角蛋白7、p53蛋白與膀胱癌臨床病理及預后的相關性

楊慧娟,楊淑君,王艷,顏子千

臨床研究表明,即使采用各項輔助治療與根治性手術治療肌層浸潤型膀胱癌(T2～T4期),患者5年生存率仍低于50%[1-2]。研究表明,角蛋白7(KRT7)主要存在于上皮細胞,能夠參與細胞間連接的形成,在維持上皮細胞完整性中扮演著重要角色[3]。KRT7主要表達于已分化的尿路上皮細胞、導管上皮細胞,可用于評估膀胱癌預后[4]。p53蛋白能夠參與基因組形成、細胞周期調控、細胞程序化死亡、DNA修復合成等多種病理過程,其可用于評估胃癌等多種惡性腫瘤預后[5]。免疫組化法是應用抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原,可精確定位所需要的細胞類型或組織區域,有助于研究腫瘤微環境中的病理特征[6]。已有報道指出,免疫組化法可用于檢測癌組織中基因蛋白表達情況,有助于分析蛋白表達情況與腫瘤患者臨床病理特征的關系[7]。目前,國內尚缺乏有關免疫組化法用于研究KRT7、p53蛋白與膀胱癌臨床病理及預后相關性的研究報道,基于此,現分析KRT7、p53蛋白與膀胱癌臨床病理及預后的相關性,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 分析2016年2月—2019年3月江蘇省連云港市第二人民醫院病理科收治的膀胱癌患者105例的臨床資料,男78例,女27例,年齡36～79(56.72±8.25)歲。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(KY-20190815008-09),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①符合膀胱癌的診斷標準,且均為膀胱尿路上皮癌;②均接受膀胱癌根治術治療;③術前沒有采用任何輔助性治療;④臨床資料完整者;⑤免疫組化中KRT7蛋白與p53蛋白均強表達。(2)排除標準:①合并其他泌尿系統疾病;②合并其他類型惡性腫瘤者;③術前發生遠處轉移者;④伴有免疫缺陷性疾病;⑤重要臟器嚴重功能障礙。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 組織取材:患者均接受膀胱癌根治術,確保術中所切取的組織包括癌旁組織(距離腫瘤組織>3 cm)與癌組織準確并于病理科檢測。術后根據患者個人情況實施放療、化療等。

1.3.2 KRT7蛋白與p53蛋白檢測:癌旁組織與癌組織均經包埋處理后,連續切取5片,蘇木精淺染,自來水沖洗,二甲苯脫蠟。分別用75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇實施梯度洗脫,加入鼠抗人KRT7單克隆抗體、鼠抗人p53單克隆抗體(均購自上海圻明生物科技有限公司)。4℃條件下孵育過夜,磷酸鹽緩沖液沖洗2～3次,加入羊抗鼠二抗(購自上海圻明生物科技有限公司),25℃條件下孵育24 h,二氨基聯苯胺顯色,蘇木素復染,中性樹膠封固。顯微鏡觀察組織切片,評估KRT7蛋白和p53蛋白在組織中的表達情況。

結果判讀:KRT7蛋白、p53蛋白陽性染色為細胞漿呈黃色或棕黃色。細胞染色強度按照無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0分、1分、2分、3分;按陽性細胞百分比<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別記為0分、1分、2分、3分、4分,染色指數(陽性細胞百分比評分×細胞染色強度)0分為KRT7蛋白、p53蛋白陰性,否則記為陽性。

1.3.3 隨訪及預后:隨訪3年,每3個月隨訪1次,以電話、微信等形式進行隨訪,以患者死亡或隨訪時間截止(2022年3月)記為隨訪終點。

2 結 果

2.1 p53蛋白、KRT7蛋白表達比較 癌組織KRT7蛋白陽性率低于癌旁組織(P<0.01),癌組織p53蛋白陽性率高于癌旁組織(P<0.01),見表1、圖1。

圖1 癌組織與癌旁組織KRT7、p53蛋白表達情況(免疫組化染色,×200)

表1 癌組織與癌旁組織KRT7蛋白、p53蛋白表達比較 [例(%)]

2.2 癌組織中KRT7蛋白、p53蛋白表達在不同臨床病理特征中的差異 T2～T4期、低分化、腫瘤直徑≥3 cm患者癌組織中KRT7蛋白陽性率低于、Ta～T1期、中高分化、腫瘤直徑<3 cm患者(P<0.05)。T2～T4期、低分化、腫瘤直徑≥3 cm患者癌組織中p53蛋白陽性率高于Ta～T1期、中高分化、腫瘤直徑<3 cm患者(P<0.01),見表2。

表2 癌組織中KRT7蛋白、p53蛋白表達在不同臨床病理特征中的差異 [例(%)]

2.3 膀胱癌患者預后的危險多因素Cox分析 以膀胱癌患者預后為因變量,以上述結果中P<0.05項目為自變量進行Cox分析,結果顯示:臨床T2～T4期、分化程度低、腫瘤直徑≥3 cm、KRT7蛋白陰性、p53蛋白陽性為膀胱癌患者預后的危險因素(P<0.01),見表3。

表3 膀胱癌患者預后的危險多因素Cox分析

2.4 KRT7蛋白、p53蛋白表達與膀胱癌患者存活率的關系分析 隨訪3年,105例膀胱癌患者失訪4例,剩余101例患者中死亡34例(33.66%);KRT7蛋白陽性失訪2例,死亡15例,存活率為77.27%(51/66);KRT7蛋白陰性失訪2例,死亡19例,存活率為45.71%(16/35),KRT7蛋白陽性患者存活率高于KRT7蛋白陰性患者(χ2=5.238,P=0.022),見圖2。p53蛋白陽性失訪2例,死亡22例,存活率為62.71%(37/59),p53蛋白陰性失訪2例,死亡12例,存活率為71.43%(30/42),p53蛋白陰性存活率高于p53蛋白陽性患者(χ2=5.115,P=0.024),見圖3。

圖2 膀胱癌組織KRT7蛋白表達與患者3年內生存的關系

圖3 膀胱癌組織p53蛋白表達與患者3年內生存的關系

3 討 論

近年來,膀胱癌的發病率呈逐漸上升的趨勢,且逐漸趨于年輕化[8]。目前,大部分膀胱癌患者初診為非肌層浸潤性膀胱癌(Ta～T1期),治療期間,癌細胞轉移與癌癥復發是影響膀胱癌患者預后的獨立危險因素[9]。相關研究指出,膀胱癌初期病情隱匿,部分患者就診時已出現遠處轉移,治療后轉移和復發是患者3年生存率低、預后較差的重要原因[10-11]。故尋找合適的預測因子預測膀胱癌患者預后,有助于臨床診治與改善預后。

本研究中,癌組織KRT7蛋白陽性率低于癌旁組織,癌組織p53蛋白陽性率高于癌旁組織,提示KRT7蛋白與p53蛋白在膀胱癌的發生中發揮著一定作用,與既往研究報道類似[12]。本研究結果顯示膀胱癌患者癌組織中KRT7、p53蛋白表達與分化程度、腫瘤直徑、臨床分期及預后密切相關。本研究中,T2～T4期、低分化、KRT7蛋白陰性、p53蛋白陽性為膀胱癌患者預后的危險因素,進一步證實了KRT7蛋白陰性、p53蛋白陽性與膀胱癌患者預后密切相關,可能原因為KRT7、p53蛋白通過調節機體染色體活性,進而影響膀胱癌患者病情的發生與發展,且臨床需重點關注低分化、T2～T4期的膀胱癌患者,及時進行治療與干預,從而降低預后不良的發生風險。相關研究指出[13],p53蛋白可分為野生型與突變型2種,前者可調控癌細胞的增殖,后者可誘導異常基因的表達,從而促進腫瘤的發生。相關研究表明[14],p53蛋白在膀胱癌中高表達,與臨床分期、病理分級等臨床病理特征密切相關,在評估膀胱癌預后中具有重要價值,分析原因:p53蛋白在細胞中起著重要的調控作用,包括對DNA損傷的應答和介導細胞凋亡等,在膀胱癌發展過程中,高表達的p53蛋白可能反映了細胞內DNA損傷的積累,并試圖通過引發細胞凋亡來抑制腫瘤生長。KRT7可調控基因表達、細胞周期、DNA復制等多種病理過程。腫瘤發生是正常染色體受到多種損傷的結果,包括DNA轉錄異常、原癌基因的過度激活、抑癌基因的失活等,因此,筆者推測KRT7可能參與了膀胱癌發生的調節。既往研究指出[15],KRT7隨著病理分級、腫瘤分期的增加而降低,提示KRT7低表達的膀胱癌患者轉移及復發風險更高。本研究中,KRT7蛋白陽性患者生存曲線優于KRT7蛋白陰性患者,p53蛋白陰性患者生存曲線優于p53蛋白陽性患者,進一步證實了KRT7蛋白陰性、p53蛋白陽性患者預后不良風險更高。既往研究表明[16],突變型p53陽性表達率≥30%的肌層浸潤性膀胱癌患者總生存時間更短,與本研究結果相符。

綜上所述,膀胱癌患者癌組織中KRT7、p53蛋白表達與分化程度、腫瘤直徑、臨床分期及預后密切相關,且KRT7蛋白陰性、p53蛋白陽性患者預后不良風險更高,但鑒于本研究納入樣本量及隨訪時間有限,研究結果仍需進一步擴大樣本量、增加隨訪時間來進行驗證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

楊慧娟、楊淑君:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫,統計學分析,論文修改;王艷、顏子千:病例收集,數據整理