CFS 預處理對不同秸稈原料酶解和理化結構的影響

田 鑫，王雨萌，徐師苗，汪強杰，胡 軻，張海波，程紅艷

（山西農業大學 資源環境學院，山西 太谷 030801）

環境問題和能源多樣化導致人們對生物質可再生資源日益關注。木質纖維素生物質分布廣泛、儲量巨大，具有生產生物燃料的巨大潛力[1]。木質纖維素生物質由纖維素、半纖維素和木質素組成，可分為草、作物秸稈、闊葉林和針葉林等[2]，其中作物秸稈由于來源廣泛，易被生物轉化，受到研究者廣泛關注。通常作物秸稈會被遺棄田地隨意堆放或被焚燒處理，導致嚴重的環境問題及資源浪費[1]，故將其資源化利用迫在眉睫。未處理作物秸稈由于木質纖維素的緊密結構，很難用于高效的生物燃料生產。因此，通過有效的預處理方式去除木質素、破壞緊密結構是高效利用作物秸稈不可或缺的一環[3]。

高鐵酸鉀（K2FeO4）擁有極強氧化性，是一種新型高效多功能水處理劑，在廢水處理中被廣泛應用[4-5]。次氯酸鹽氧化法是一種成熟的高鐵酸鉀制備技術，其原理是在強堿溶液中加入過量ClO-氧化Fe3+制備高濃度的K2FeO4溶液，再經結晶、純化干燥后形成固體K2FeO4[6]。高鐵酸鉀復合液（CFS）是制備高鐵酸鉀的剩余廢棄濾液，其內含有大量堿（OH-）與氧化劑（Fe6+和ClO-）[7]。大量研究已證實，OH-和ClO-具有斷裂木質素與半纖維素間的酯鍵以及木質素間的醚鍵，降解木質素，破壞木質纖維素復雜結構的作用[8-11]。由此推測，CFS 同樣具備較強的木質纖維素降解能力。然而，目前并無CFS 預處理木質纖維素原料的相關報道。

玉米秸稈（CS）、高粱秸稈（SS）和谷子秸稈（MS）為山西省主要糧食作物秸稈，每年產量高達1 600 萬t[12]。這3 種秸稈的生物轉化潛力已被報道過，例如LI 等[13]采用高溫烘烤對玉米秸稈進行預處理，還原糖得率提高了46.41%。DAI 等[14]以高粱秸稈生物廢料為原料，經葡萄糖酸預處理后的高粱秸稈固體可獲得90.8%的酶解率。YADAV等[15]利用球形毛殼菌對珍珠谷子秸稈進行預處理，發現在預處理后的珍珠谷子秸稈中添加降解細菌可提高沼氣產量57%。由于3 種秸稈原料化學組分、理化結構具有差異性，其生物轉化潛力也不同。此外，酶水解產糖率是評估預處理的關鍵指標[16]。

本研究采用CFS 對CS、SS 和MS 進行預處理，首先，評價了CFS 預處理對3 種秸稈的酶解糖化效果；其次，分析了CFS 預處理前后3 種秸稈木質纖維素含量的變化；最后，利用掃描電鏡（SEM）、原子力顯微鏡（AFM）、傅立葉變換紅外光譜（FTIR）、X-射線衍射儀（XRD）、熱重（TG）等測試技術，對比分析了CFS 預處理前后3 種秸稈理化結構的變化，進一步評估了CFS 預處理3 種秸稈的效果。CFS 為制備高鐵酸鉀的剩余廢液，采用CFS對作物秸稈進行預處理實現了“以廢治廢”的目的，可為生物能源的生產提供新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

CS、SS、MS 均取自山西省晉中市太谷區，新鮮秸稈切斷至1～2 cm，風干，于60 ℃烘箱烘干、粉碎后過0.25 mm 篩，儲存備用。試驗中所用的水解酶為纖維素酶（50 U/mg）和葡萄糖苷酶（100 U/g）。Fe（NO3）3?9H2O、KOH、NaClO、3，5-二硝基水楊酸等藥品均為分析純，購自天津市化學試劑有限公司。

1.2 預處理試驗

在預處理前，采用次氯酸鈉法[7]制備高鐵酸鉀，收集其濾液即為CFS，濾液內Fe6+、ClO-、OH-的含量分別為40.2、704.5、2 500.1 mmol/L。預處理試驗在250 mL 三角瓶中進行，固液比設置為10%（m/V）。具體操作步驟為：首先將秸稈粉末置于三角瓶中，加入CFS 并將三角瓶放入25 ℃恒溫振蕩器（SHZ-82A，常州，華冠）中，同時設置不同預處理時間（3、6、12、24、48 h）。在規定時間內取樣，用去離子水多次沖洗樣品，將其置于60 ℃的烘箱中烘干后稱量裝袋，備用。所有試驗均進行3 次重復。

單獨OH-預處理試驗所采用的化學試劑為KOH，配制濃度等同于CFS 中OH-濃度，其余操作步驟同上。

1.3 酶解糖化

稱取0.8 g 預處理樣品置于100 mL 塑料瓶中，加入經121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min、pH 值為4.8的0.1 mol/L 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，使酶解液總體積為40 mL。然后分別加入纖維素酶（50 U/mg）和葡萄糖苷酶（100 U/g），將其置于50 ℃的培養箱中酶解糖化48 h，經離心分離后取上清液，測定濾液中還原糖含量。

式中，C代表根據標準曲線上計算出的樣品測定管中葡萄糖含量（mg）；Vt代表樣品提取液總體積（mL）；W代表樣品干質量（g）；Vs代表測定時取樣體積（mL）。

1.4 指標分析方法

采用分光光度法[17]在515 nm 波長下測定Fe6+的濃度；向紫紅色CFS 中加入Ba（NO3）2，通過生成難溶物BaFeO4去除濾液顏色，獲取無色濾液后，再分別采用碘量法[18]和滴定法（酚酞指示劑）測定濾液中的ClO-和OH-；使用DNS 法[19]測定溶液中還原糖含量；采用Van Soest 法[20]測定秸稈中的纖維素、半纖維素和木質素含量；秸稈樣品噴金后，利用掃描電鏡（Regulus8100，日本，日立）觀察預處理前后秸稈表面形態變化；使用原子力顯微鏡（Bruker Dimension lcon，德國，Bruker）采集預處理前后秸稈樣品的振幅圖和三維高度圖；秸稈樣品經KBr 壓片后，置于PerkinElmer 傅立葉紅外測試儀（Tensor 27，德國，Bruker）中掃描測定表面官能團結構變化；采用XRD 儀（布魯克D8 advance，德國，Bruker）分析秸稈樣品，并計算纖維素結晶度[21]；將預處理前后秸稈樣品干燥后用同步熱分析儀（STA 449C，德國，耐馳）分析樣品的熱穩定性。

1.5 數據分析

采用Microsoft Excel 2016 軟件整理試驗數據；使用Origin Pro 2018 軟件作圖；使用SPSS 22.0 軟件（P＜0.05）進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 預處理對3 種秸稈酶解糖化的影響

酶水解產糖率是評估預處理效率的關鍵指標[16]。3 種秸稈的還原糖產量隨CFS 預處理時間變化趨勢如圖1 所示，未處理的CS、SS、MS 的還原糖產量較低，分別為88.76、86.39、65.36 mg/g。當預處理時間由3 h 增加至24 h 時，3 種秸稈的還原糖含量顯著升高（P＜0.05），隨預處理時間繼續增加，還原糖含量基本保持不變，且差異不顯著（P＞0.05）。在最佳預處理時間24 h 時，CS 的還原糖含量最高，為313.12 mg/g，其次為SS（290.61 mg/g），MS 的還原糖含量最低（206.97 mg/g），較未處理對照分別顯著提高了252.77%、236.39%、216.66%（P＜0.05）。以上結果充分說明，CFS 預處理可成功破壞秸稈緊密結構，促進后續的酶解糖化過程，同時最佳預處理時間為24 h。相較SS 和MS，預處理前后CS 的還原糖含量最高，說明CS 生物轉化潛力最大，這可能是由秸稈內部化學組成和理化結構共同決定的。

圖1 預處理時間對3 種秸稈酶解糖化的影響Fig.1 Effects of pretreatment time on enzymatic hydrolysis and saccharification of three kinds of straw

為進一步了解CFS 對秸稈的降解情況，分析了CFS與單獨OH-預處理（濃度同CFS中OH-濃度）對3 種秸稈還原糖含量的影響，結果如圖2 所示，經單獨OH-預處理后，CS、SS、MS 的還原糖含量較未處理分別顯著提高了207.72%、179.50%、138.34%（P＜0.05）。而經CFS 預處理后，CS、SS、MS 的還原糖含量則高于單獨OH-預處理，分別較單獨OH-預處理顯著增加了14.64%、15.56%、15.12%（P＜0.05）。說明OH-和CFS 預處理均可降解木質纖維素，增加纖維素酶的可及性。

圖2 CFS 和單獨OH-處理對3 種秸稈酶解糖化的影響Fig.2 Effects of CFS and individual OH- treatments on enzymatic hydrolysis and saccharification of three kinds of straw

CFS 預處理效果明顯優于單獨OH-預處理，暗示CFS 中氧化劑（ClO-/Fe6+）在秸稈的降解過程中發揮一定的作用。氧化還原電位（ORP）是反映體系中所有物質表現出來的宏觀氧化-還原性[22]，ORP 越高，則氧化性越強。由預處理過程中ORP 變化趨勢可知（圖3），CFS 預處理3 種秸稈在前24 h 的ORP值由400 mV 顯著降低至-800～-600 mV（P＜0.05），進一步驗證了CFS 中氧化劑參與了秸稈降解。

圖3 CFS 和單獨OH-處理對3 種秸稈預處理過程中ORP 變化的影響Fig.3 Effects of CFS and individual OH- treatments on ORP changes during pretreatment of three kinds of straw

2.2 預處理前后化學組分含量的變化

木質纖維素生物質主要由纖維素、半纖維素和木質素等成分組成，這些成分共同構成了復雜三維網狀結構，尤其是木質素對纖維素和半纖維素的保護作用，使纖維素酶難以在酶解過程中直接接觸纖維素[23]。由圖4 可知，3 種秸稈木質素含量為CS 和SS 較低，而MS 最高；纖維素含量大小則表現為CS＞SS＞MS。CS 含豐富纖維素和較少木質素的特點，暗示其生物轉化潛力較強。經CFS 預處理后，與未處理相比，CS、SS、MS 纖維素含量分別提高了26.75%、19.71%、10.50%，且差異顯著（P＜0.05），木質素含量分別顯著降低了51.81%、41.30%、26.43%（P＜0.05），半纖維素含量分別顯著降低了29.33%、12.61%、8.18%（P＜0.05）。說明CFS 預處理已去除了大量的木質素和半纖維素，導致纖維素相對含量升高，這可能與復合液中堿和氧化劑具有破壞木質素與半纖維素間的酯鍵以及木質素間的醚鍵的能力相關[24-25]。雖然CFS 預處理對MS 木質素有一定程度的去除，但其內部高含量木質素與纖維素和半纖維素形成的緊密交聯結構使得木質素去除效果不如CS 和SS 明顯。另外，MS 纖維素含量低的特點導致其酶解效率遠低于CS 和SS（圖1）。

不同小寫字母表示同種木質纖維素不同處理間差異顯著（P＜0.05）The different lowercase letters indicated significant difference between the different treatments of the same lignocellulose(P＜0.05)圖4 CFS 預處理前后3 種秸稈的化學組分含量Fig.4 Chemical components content of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

2.3 預處理前后秸稈形態結構的變化

2.3.1 預處理前后秸稈掃描電鏡（SEM）分析 為進一步了解秸稈的微觀結構變化，利用掃描電鏡（SEM）觀察預處理前后3 種秸稈表面形態，結果如圖5 所示，未處理的秸稈纖維結構完整且緊密，形狀規則，排列整齊，表面光滑，無明顯的破壞，這些纖維層會阻礙了微生物對秸稈的利用。經過CFS預處理后，秸稈的表面形態變化明顯。預處理后的CS 表面結構發生扭曲和破壞，表面粗糙度增加，呈中空結構，SS 的表面纖維排列疏松、膨脹并伴有裂紋，MS 纖維表面暴露程度增加并出現裂紋。預處理對CS 表面形態的破壞較SS 和MS 更為嚴重，原因可能是由于CFS 預處理CS 后去除更多的木質素或半纖維素，使秸稈表面粗糙并出現裂紋，這會增大秸稈的表面積，有利于進一步酶解反應。

圖5 CFS 預處理前后3 種秸稈的SEM 圖像Fig.5 SEM images of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

2.3.2 預處理前后秸稈AFM 分析 原子力顯微鏡（AFM）形成的高分辨率形貌圖，可在納米尺度上顯示秸稈表面微觀結構的變化[26]。預處理前后3 種秸稈的振幅圖和三維高度圖如圖6 所示，AFM圖像的明暗分別代表秸稈的親疏水性，纖維素是親水的（每個糖環含有3 個羥基），而木質素是疏水的[27]。未處理秸稈表面有1 層疏水性的木質素，振幅圖顏色較暗，說明秸稈原料含較多的木質素；而CFS 預處理后秸稈表面明亮，這表明部分木質素被去除，更多的親水性纖維素被暴露出來[27]。在3 種秸稈中，MS 的顏色最深，這與其木質素含量高的分析結果一致（圖4）。另外，粗糙度參數Ra和Rmax（表1）分別代表平均表面粗糙度以及高、低數據點之間的最大垂直距離，其數值越大代表秸稈表面越粗糙。預處理后CS、SS、MS 的粗糙度參數Ra分別從處理前的17.8、13.5、13.0 nm 增加到122.0、25.7、19.3 nm，Rmax分別從處理前的192、147、117 nm 增加到890、754、471 nm。說明預處理后3 種秸稈的粗糙度均增加，其中CS 粗糙度最大，這與SEM 的觀察結果一致（圖5）。

表1 CFS 預處理前后3 種秸稈表面粗糙度參數Tab.1 Surface roughness parameters of three kinds of straw before and after CFS pretreatmentnm

圖6 CFS 預處理前后3 種秸稈的AFM 圖像Fig.6 AFM images of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

2.3.3 預處理前后秸稈FTIR 分析 FTIR 可分析預處理前后3 種秸稈表面官能團和化學鍵變化，從而定性推測3 種秸稈化學組分變化。3 種秸稈預處理前后的FTIR 進行了比較，結果如圖7 所示，預處理前后3 種秸稈的特征吸收峰形狀基本相似，但一些特征峰呈不同程度的增強或減弱，說明CFS 預處理改變了秸稈的化學組分和結構。其中，在波數3 326 cm-1處出現寬峰，對應纖維素分子間氫鍵引起的-OH 伸縮振動[28]；波數2 917 cm-1處代表纖維素-CH2的拉伸振動[27]，CFS 預處理可使上述2 波峰明顯變寬或變強；波數890 cm-1處是纖維素內葡萄糖單元間β-糖苷鍵的特征峰[23]，預處理增強了該處波峰強度，說明CFS 預處理可有效保留纖維素，使纖維素相對含量增加。在波數1 735 cm-1處非共軛羰基-C=O 伸縮振動的吸收峰是木質素-半纖維素復合物的糖醛酸酯基團特征峰[9]，在預處理后明顯減弱或消失，這是由于CFS 中的OH-能與酯鍵發生皂化反應，使得木質素與纖維素、半纖維素間的結構被打開，乙酸和酚類物質被釋放出來[29]。波數1 235 cm-1處的吸收峰為木質素（愈創木基）中C=O 的伸縮振動[9]，波數1 605、1 515 cm-1的振動可歸因于木質素鏈的芳香C-C 拉伸[26]，波數834 cm-1處為木質素中紫丁香基中的C-H 面外彎曲振動[30]。CFS 預處理后可減弱以上4 個峰的強度，說明預處理后3 種秸稈中有大量木質素被溶解。

圖7 CFS 預處理前后3 種秸稈的FTIR 圖像Fig.7 FTIR images of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

2.3.4 預處理前后秸稈XRD 分析 纖維結晶度（CrI）也會影響木質纖維素生物質酶解效率[31]。預處理前后3 種秸稈的XRD 圖譜如圖8 所示，圖譜22.46°處為結晶區特征峰，15.98°處為非結晶區特征峰，所有圖譜均在22.46°和15.98°附近出現2 個特征峰，說明預處理對秸稈的晶體類型沒有顯著影響，仍為結晶和非結晶區共存。而經CFS 預處理后，結晶區特征峰強度明顯增大，峰值更尖銳。根據Segal 公式[21]計算可知，預處理后3 種秸稈的CrI大小分別表現為CS（55.40%）＞SS（49.30%）＞MS（44.44%），分別較未處理增加了26.77%、26.60%和23.17%。以上結果說明CFS 主要破壞秸稈的非結晶區，使部分的可溶性多糖、木質素、半纖維素和非晶型纖維素等無定形區域物質被溶解，導致結晶纖維素相對含量升高[32]，這與其他研究結果相類似，例如，稀酸預處理、蒸汽爆破和堿性H2O2預處理秸稈[30,32-33]。預處理后CS 的結晶纖維素相對含量最高，高的纖維素含量可為纖維素酶提供更多反應底物，這進一步驗證了預處理后CS 含豐富纖維素和較少木質素（圖4）且酶解效率高（圖1）的結論。

圖8 CFS 預處理前后3 種秸稈的XRD 圖像Fig.8 XRD images of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

2.3.5 預處理前后秸稈TG 分析 通過TG 分析可測定木質纖維素的熱穩定性[27]。熱解過程的TG 曲線和DTG 曲線如圖9 所示，半纖維素、纖維素和木質素的降解溫度分別為180～340、230～450、180～900 ℃[28]。由圖9 可知，秸稈預處理前后的熱解經歷了3 個階段：干燥、高效熱解和成炭，這與其他生物質熱解過程類似，如松木[34]、帕拉草[35]和珍珠谷子殘渣[36]。干燥階段的溫度范圍為室溫至150 ℃，主要涉及表面張力保持的外部水分和細胞內部水分的釋放[37]。高效熱解階段（150～600 ℃）主要涉及揮發性產物釋放，半纖維素和纖維素完全降解與木質素部分降解[28]。第2 階段的質量損失最大，為72.87%～91.50%。第3 階段（600～900℃）主要為木質素分解階段，失重率為2.65%～10.48%。由圖9 還可知，CFS 預處理后3 種秸稈DTG 曲線的峰值溫度均發生了變化，但不影響降解過程。預處理前CS、SS、MS 的峰值溫度分別為349.18、354.88、346.04 ℃，預處理后CS、SS、MS 的峰值溫度分別為355.48、356.54、357.58 ℃。此外，預處理后3 種秸稈的最大質量損失速率（DTGmax）也隨之提高，預處理前CS、SS、MS 的DTGmax分別為每分鐘12.22%、13.42%、8.07%，預處理后的DTGmax分別升高至每分鐘17.32%、15.69%、14.52%。說明預處理后3種秸稈的熱穩定性均變差，其原因可能是預處理使3 種秸稈的纖維素含量升高。與SS 和MS 相比，CS的熱穩定性最差，故其被轉化為生物燃料的潛力最大。

圖9 CFS 預處理前后3 種秸稈的TG 和DTG 圖像Fig.9 TG and DTG images of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

3 結論與討論

CFS 可有效破壞作物秸稈頑固結構促進酶解糖化過程。本研究通過分析對比CFS 預處理對3 種秸稈酶解糖化的影響發現，在最佳預處理時間24 h下，CS、SS 和MS 的還原糖含量分別較對照提高了252.77%、236.39%、216.66%，CS 的酶解糖化效率最高；CFS 預處理中堿和氧化劑共同參與了木質纖維素的降解；ORP 變化進一步驗證了CFS 中氧化劑參與了降解秸稈。高靜等[38]使用離子液預處理水稻秸稈，1-乙基-3 甲基咪唑醋酸鹽/環己烷/TX-100/正丁醇微乳液在500 MPa、50 ℃預處理4 h，還原糖產率為75.3%。JIN 等[2]采用高壓均質預處理玉米秸稈，雖然沒有廢液產生，但該處理耗能高，且還原糖含量僅為161.62 mg/g，較對照提高68.4%。MA 等[24]用2%（W/V）的堿性高錳酸鉀預處理玉米芯，在50 ℃預處理6 h，還原糖產量為對照的1.44 倍。陳思哲等[39]用氫氧化鈉預處理水稻秸稈，在80 ℃預處理3 h，還原糖含量為480.81 mg/g，較對照提高了262.3%。上述研究預處理成本高，且預處理效果低于本研究。與不同處理的預處理技術相比，CFS 預處理是一種有效且成本低廉的處理技術。

本研究通過分析對比CFS 預處理對3 種秸稈理化結構的影響發現，CFS 預處理能有效去除3 種秸稈中木質素成分，增加纖維素相對含量，破壞秸稈的緊密結構，提高了纖維素酶的可及性；CFS 預處理后，3 種秸稈的理化結構發生了不同程度變化，粗糙度增加，官能團發生斷裂，纖維素結晶度升高，熱穩定性降低，3 種秸稈中，CS 變化最明顯，其生物轉化潛力最大。秸稈中纖維素成分與木質素、半纖維素成分緊密結合，使得酶分子難以與纖維素分子接觸，阻礙了纖維素的酶解反應[39]。木質素的去除可以增加底物與纖維素酶或微生物的接觸機會，從而提高木質纖維素的糖化率[38]，有利于秸稈的資源化利用。纖維結晶度升高說明預處理去除了秸稈中的木質素和半纖維素成分，破壞了纖維素的無定形結構[39]，可為纖維素酶提供更多的反應底物，從而提高酶解糖化效率。木質素的降解和結晶度的升高等指標的變化，說明CFS 預處理能有效破壞木質纖維素的復雜頑固結構，有利于后續酶解糖化，被微生物所利用。

綜上，CFS 預處理破壞作物秸稈的致密結構，促進酶解效率，是一種理想的預處理方法。此項預處理技術的研究結果實現了“以廢治廢”的綠色環保目標，為農業廢棄物的資源化利用提供了新思路。