BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56四種抗體聯合檢測在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的應用價值

姚麗倩 顧婷婷

江蘇大學附屬昆山醫院 昆山市第一人民醫院病理科，江蘇昆山 215300

甲狀腺癌是常見的內分泌器官惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見類型[1]。雖然大部分PTC惡性度低，預后良好，但是仍有10%的患者發生侵襲及遠處轉移，且發病人群年輕化[2]。目前臨床上超聲引導下細針穿刺活檢細胞學是診斷PTC的有效方法，但因超聲穿刺取樣、人工制片及病理醫生閱片等多方面的原因，只有70%～80%的患者得以確診[3]。研究表明，特異性分子標志物可提高甲狀腺良、惡性結節的診斷準確度。近年來，已有研究建議將鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）、細胞角蛋白19（cytokeratin19，CK19）、人骨髓內皮細胞標志物（human bone marrow endothelial markers，HBME-1）和神經細胞黏附分子（neural cell adhesion molecule 56，CD56）等分子標志物用于臨床診斷PTC，但這些標志物的可靠性還存在較大的爭議[4]。本文旨在探究BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56四種抗體單獨和聯合檢測診斷PTC的效果，確定其在臨床診斷PTC的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年11月至2022年11月昆山市第一人民醫院（本院）病理科179例甲狀腺手術標本，其中62例結節性甲狀腺腫、腺瘤等結節為良性組，117例PTC結節為惡性組。良性組男10例，女52例；年齡25～78歲，平均（52.9±13.48）歲；平均病程（16.85±6.21）個月。惡性組男36例，女71例；年齡26～76歲，平均（43.45±11.71）歲；病程（12.95±4.25）個月；腫塊直徑0.1～3.8 cm，平均（0.92±0.35）cm。納入標準：無其他腫瘤病史、免疫系統及感染性疾病史；無手術史及放化療史。排除標準：免疫組織化學檢測指標不完整；術前合并髓樣癌、濾泡癌等其他類型腫瘤。本研究經本院醫學倫理委員會審核批準（倫理審批號：2021-06-040-K01）。

1.2 免疫組織化學方法

常規石蠟制片，厚度3～4 μm切片備用。EnVision法染色，DAB顯色，蘇木精復染。一抗BRAFV600E抗體（克隆號VE1）購自Roche公司，CK19、HBME-1、CD56單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，嚴格按照說明書操作。

1.3 結果判讀

顯微鏡觀察切片染色情況，無著色0分、黃色1分、棕色2分、褐色3分。陽性細胞數＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。著色強度與陽性細胞數百分比兩項所得分數相乘，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～6分為陽性（++），＞6分為強陽性（+++）[5]。結果由兩名高年資醫師判讀。

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTC病理巨檢及蘇木精-伊紅染色特點

PTC結節肉眼觀察多為灰白、實性、質中，與周圍甲狀腺組織界限欠清。組織學上PTC細胞呈乳頭狀結構及腺管樣結構，細胞核偏大，呈毛玻璃狀，可見核重疊、核溝及核內包涵體。

2.2 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56抗體在甲狀腺良、惡性結節的表達

對179例甲狀腺結節行免疫組化染色，BRAFV600E表達定位于PTC細胞胞質，多呈中-強陽性（圖1A）；CK19表達定位于PTC細胞胞質，多呈彌漫強陽性（圖1B）；HBME-1表達定位于PTC細胞胞質及胞膜，呈中-強陽性（圖1C）；CD56表達定位于甲狀腺濾泡上皮細胞胞膜，呈強陽性，PTC細胞為陰性（CD56在PTC細胞膜染色陰性作為診斷PTC的陽性判斷）（圖1D）。

圖1 PTC細胞BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56抗體免疫組化染色

BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56在PTC結節和良性結節中表達率比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。本組117例PTC中，BRAFV600E陽性100例（85.47%），CK19陽性117例（100.00%），HBME-1陽性116例（99.15%），CD56陰性109例（93.16%）；62例良性結節中，BRAFV600E陽性3例（4.84%），CK19陽性26例（41.94%），HBME-1陽性5例（8.06%），CD56陰性6例（9.68%）。見表1。

表1 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56在甲狀腺良、惡性結節表達率比較

2.3 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56在甲狀腺良、惡性結節的診斷效能

BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56聯合診斷PTC時，聯合診斷的靈敏度、特異度和準確性均高于各項指標單獨診斷的靈敏度、特異度及準確性，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。靈敏度=真陽性例數/（真陽性+假陰性）例數×100%；特異度=真陰性例數/（真陰性+假陽性）例數×100%；準確性=（真陽性+真陰性）/總例數×100%。見表2。

表2 BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56診斷PTC的效能（%）

3 討論

甲狀腺結節可發生于各個年齡段，女性居多，患者多無明顯癥狀，少數會出現咽喉疼痛不適感[2]。PTC多分化較好，易與良性增生病變混淆。其次甲狀腺炎癥時，間質纖維組織增生，又易導致臨床發生誤判。免疫組化是目前臨床病理普及的方法，當多種抗體優化組合能更有效地鑒別甲狀腺良、惡性結節。

BRAF在絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路中，通過激活P21從而修復基因損傷，是一種抑癌基因。甲狀腺中，該基因突變導致編碼蛋白異常，使其失去抑癌作用，進而引起細胞發生異型增生，導致癌變[6]。目前與BRAF基因突變相關研究多建立在基因水平上，而禹樂等[7]研究表明，運用免疫組化方法檢測BRAFV600E表達產物（單克隆抗體VE1）與BRAFV600E基因突變有高度一致性。本研究中，良性組BRAFV600E抗體陽性率為4.84%，且染色均為輕-中等強度；惡性組BRAFV600E陽性表達率85.47%，明顯高于良性組，且染色均為中-強陽性。BRAFV600E診斷PTC特異性達95.16%，靈敏性85.47%，準確性88.83%，是診斷PTC的可靠標志物。CK19是一類低分子量角蛋白，通常表達于膽管、胰腺等上皮細胞[8]。近年來研究發現，CK19在PTC中表達水平較高，多表現為中等及以上強度表達，靈敏度高達100%。但是，CK19特異度不高，在甲狀腺良性病變也可呈陽性表達，只是表達強度及陽性率不穩定[9]。結果顯示，CK19在PTC結節的靈敏度也為100%，但其特異度僅58.06%，診斷準確性為85.47%。值得注意的是，CK19在良性結節中的陽性率雖達到了41.93%，但其染色均為中等及以下強度，而在PTC結節中，均為彌漫強陽性，說明CK19中等以上強度著色對PTC有較好的警惕性作用，但其低特異性導致其在臨床應用受限[10]。HBME-1是一種特異性抗原成分，存在于間皮細胞表面微絨毛，常在間皮瘤和一些腺癌細胞中表達，在腫瘤中起促進血管形成及細胞增殖作用，進而促進腫瘤進展[11]。相關研究報道，HBME-1在PTC組織中特異度和靈敏度均較高，且多呈中度或強陽性表達，而在結節性甲狀腺腫等良性病變中很少表達，其在PTC結節和甲狀腺良性結節的表達率比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）[12]。本研究結果中，HBME-1在甲狀腺癌組織中陽性表達率為99.15%，在甲狀腺良性結節中的陽性表達率為8.06%，診斷PTC的特異性為91.93%，準確性高達96.65%。可見，HBME-1在用于PTC的診斷與鑒別診斷時，是比較理想的標志物。臨床診斷中，可選擇特異度高的HBME-1和靈敏度強的CK19蛋白聯合診斷PTC，大大提高其診斷準確性。CD56在NK細胞、星形細胞、施萬細胞、神經元及少量活化的T細胞中表達，是神經細胞黏附、神經外胚層及神經內分泌組織細胞的介導因子，CD56表達缺失或降低可促進腫瘤的增殖和遷移，還與患者預后相關[13]。研究顯示，CD56蛋白在PTC中表達缺失，在甲狀腺正常濾泡上皮細胞及良性病變中呈陽性表達[14]。本研究結果表明，惡性組CD56陰性表達率為93.16%明顯高于良性組的9.68%，CD56靈敏度、特異度和準確性均高達90%以上。郭宏義等[15]研究表明，合理地聯合應用分子標志物能顯著提高臨床診斷PTC的準確性。這一結果與本研究結果相吻合，具有可信度。同時提示在甲狀腺良、惡性結節鑒別診斷中，從抗體的表達水平，抗體的染色強度等多個角度綜合判定，可大大提高PTC的診斷準確性。本研究中BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56聯合抗體診斷PTC的靈敏度、特異度和準確性均達到100.00%，診斷效能均高于各個抗體單獨使用，說明抗體合理地聯合使用是診斷PTC的極可靠的輔助工具。

綜上所述，BRAFV600E、CK19、HBME-1和CD56是甲狀腺良、惡性病變鑒別診斷的重要輔助指標，CK19陽性表達是診斷PTC的敏感性指標，BRAFV600E、HBME-1異常過表達和CD56表達缺失是診斷PTC的特異性分子標記，合理運用這四種標志物組合，聯合檢測有助于臨床提高PTC的診斷準確性。同時，運用免疫組化方法檢測BRAFV600E突變較基因測序成本低、效率高，具有一定的社會效益，值得推廣。