宏基因組二代測序技術在2型糖尿病合并肺部感染患者中的臨床應用

牛凱 劉斌

糖尿病是臨床常見的慢性代謝性疾病,易并發感染,其中肺部感染約占糖尿病合并感染的45%,病死率可達41%[1]。糖尿病患者肺部感染的病原體種類繁多,不乏多重耐藥菌、真菌等[2-3],鑒別診斷較為困難,給臨床決策帶來極大困擾及挑戰,因此確定其病原學尤為重要。傳統病原學檢測靈敏度差,檢測時間長,病原學覆蓋面窄[4],而宏基因組二代測序技術(metagenomic Next Generation Sequencing,mNGS)可早期、快速、精準鑒定各種感染性疾病的病原學診斷,此外mNGS技術檢測到越來越多的罕見病原體,為部分重癥或疑難病例的診斷提供了一種快速有效的策略[5]。本研究回顧性的分析了糖尿病合并肺部感染患者的宏基因二代測序檢測的病原學結果,為mNGS的臨床應用提供參考。

資料與方法

一、研究對象

回顧性收集2021年11月至2023年3月入住阜陽市人民醫院呼吸與危重癥醫學科的2型糖尿病合并肺部感染患者的臨床資料共103例,收集患者的臨床資料。病例入選標準:均符合2021年美國糖尿病協會(American Diabetes Association,ADA) 制定的《糖尿病醫學診療標準》[6];納入的所有患者符合社區獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)[7]或醫院獲得性肺炎(hospital-acquired pneumonia,HAP)[8]或重癥肺炎的診斷標準[8],且患者簽署纖支鏡下肺泡灌洗術知情同意書及 NGS檢測知情同意書。排除標準:(1)患1型糖尿病、妊娠期糖尿病和特殊類型糖尿病患者。(2)未成年人。(3)樣本未通過mNGS質量控制。(4)結合臨床資料最終診斷為非肺部感染性疾病。(5)臨床資料及實驗室資料不完整。本研究符合醫學倫理學標準,經阜陽市人民醫院倫理委員會審查同意(醫倫理審查[2022]14號)。

二、研究方法

所有入組患者均留取肺泡灌洗液、痰液、外周血、胸水、肺組織等標本至少2份,分別送檢mNGS和傳統培養。傳統培養檢測:采用法國生物梅里埃生產的VITEK2 COMPACT檢測儀進行病原體鑒定,并根據《全國臨床檢驗操作規程》(第 3 版)進行相關操作。mNGS檢測:所有標本的mNGS由天津金匙醫學科技有限公司合肥實驗室完成(執業許可登記號:PDY83828512011417P1202)。通過樣本處理、核酸提取、文庫構建和測序、生物信息學分析以及結果解讀獲得mNGS檢測陽性結果,檢測結果報告在樣本送檢后的48～72h內獲得。因患者經濟原因,本研究mNGS僅對DNA進行測序,因此未將RNA病毒納入分析范圍。

三、檢測結果判讀

參考《中國宏基因組學第二代測序技術檢測感染病原體的臨床應用專家共識》的推薦意見[9],并最終根據檢測結果,結合序列數、化驗指標、影像學改變、臨床癥狀及體征及治療效果,鑒別定植菌及假陽性結果,由經驗豐富的3位正高級職稱醫生進行綜合判定,確定致病菌,并進行資料的同步收集。

四、統計分析

使用SPSS 26.0進行數據分析,計量資料使用平均值±標準差表示;計數資料使用n(%)表示,使用配對χ2檢驗進行統計分析,P<0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

一、患者基本特征

共103例患者,其中男性69 (66.9%)例,女性34 (33.1%)例,平均年齡(65.80±12.15)歲。有吸煙史的患者63 (61.2%)例;有飲酒史的患者有44 (42.7%)例;糖尿病病程10年以上的患者有38 (36.9%)例;有肺部基礎疾病的患者有43 (41.7%)例;糖化血紅蛋白(HbA1c)<7%的患者有25 (24.3%)例;HbA1c≥7%的患者78 (75.7%)例;有慢性心腦血管疾病的患者有42 (40.8%)例(見表1)。

表1 103例患者基本特征

二、兩種方法病原體檢出分布

103例臨床送檢樣本中有92例肺泡灌洗液,3例痰液,2例胸水,3例血液,3例組織。通過mNGS共檢出可供參考的病原體73種,其中細菌47種,真菌10種,病毒16種,其中細菌檢出率排前三位的是銅綠假單胞菌(16.94%)、鮑曼不動桿菌(9.60%),嗜麥芽窄食單胞菌(9.03%)(見表2)。傳統病原學培養共檢出病原體21種,其中細菌 16種,真菌5種;檢出率排前三位的是銅綠假單胞菌(25.00%)、鮑曼不動桿菌(15.90%)、嗜麥芽窄食單胞菌(13.63%)(見表3)。同時通過mNGS檢出了罕見的致病病原體,如鸚鵡熱衣原體、惠普爾養障體、總狀毛霉等。

表2 mNGS檢測出的病原體分布

表3 傳統病原學檢測出的病原體分布

三、兩種方法檢測結果比較

入組的103例患者均行mNGS及傳統病原學檢測,mNGS檢測的陽性率高于傳統檢測陽性率(81.55%vs42.72%),兩種差異具有統計學意義(χ2=33.013,P<0.001)(見表4)。

表4 mNGS與傳統檢測方法的檢測結果

在40例兩種檢測結果均陽性的病例中,有5例檢測結果完全一致,28例部分一致,7例完全不一致(見圖1)。

圖1 mNGS與傳統方法的一致性

四、兩種方法檢出致病微生物的效能

根據最終臨床診斷,mNGS標本中,76份確診最終病原體(40例細菌感染、13例結核分枝桿菌感染、16例曲霉菌感染、5例毛霉菌感染、1例肺孢子菌感染、1例甲流病毒感染);傳統病原學標本中,42份確診最終病原體(31例細菌感染、6例白色念珠菌感染、5例曲霉菌感染)。mNGS對致病菌的明確率高于傳統病原檢測(73.78%vs40.77%,P<0.05),但是兩者一致性較差(Kappa=0.179<0.4),結果具有統計學意義(χ2=22.933,P<0.001)。以臨床最終診斷為金標準,進一步計算兩種檢測方法的敏感度、特異度、陽性預測值(Positive predictive value,PPV)及陰性預測值(Negative predictive value,NPV),用以評估兩種方法的檢測效能。結果顯示,mNGS敏感度高(92.68%vs51.21%,χ2=31.110,P<0.001),但是特異度低(61.90%vs90.47%,χ2=4.725,P<0.05)(見表5)。

表5 mNGS與傳統檢測方法的診斷效能

五、mNGS在不同亞組檢測陽性率對比

根據入組患者年齡,將≥60歲的患者分為老年組,<60歲分為非老年組;根據入組患者糖尿病病程,將患者分為糖尿病長病程組(≥10年)與糖尿病非長病程組(<10年);根據糖化血紅蛋白水平,將患者分為血糖控制良好組(HbA1c<7%)和血糖控制欠佳組(HbA1c≥7%);根據是否合并基礎肺疾病,將患者分為肺基礎疾病組和無肺基礎疾病組。

對各分組mNGS的檢測陽性率進行對比分析發現,老年組與非老年組(80.28%vs84.37%,P>0.05)、糖尿病長病程組與糖尿病非長病程組(78.94%vs83.07%,P>0.05)、血糖控制良好組與血糖控制欠佳組(88.00%vs79.48%,P>0.05)之間mNGS的檢測陽性率之間無統計學差異,合并肺基礎疾病組與無肺基礎疾病組(93.02%vs73.33%,P<0.05)之間mNGS的檢測陽性率之間有統計學差異(見表6)。

表6 mNGS在各亞組之間的陽性率對比

討 論

糖尿病是一種臨床常見的慢性代謝性疾病,易并發各種感染,其中并發肺部感染的發生率高,是造成糖尿病患者主要死因之一[10]。對于此類患者最主要的問題是如何找到病原學,從而對臨床抗感染治療提供幫助,進一步提高治療效果,減少死亡率,而傳統檢測方法有其局限性,mNGS以快速、精準、陽性率高等優勢,進一步在感染性疾病中,起到了重要的作用。

本次檢出的致病微生物中革蘭氏陰性菌在致病菌中占比高,mNGS的陽性檢出率明顯高于傳統的微生物培養(81.55%vs42.72%,P<0.05),與先前國內研究一致[11-12]。進一步分析后發現,革蘭氏陰性菌中較常見的致病菌有銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、肺炎克雷伯桿菌等,革蘭氏陽性菌中金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌較為多見,真菌中曲霉菌多見,病毒感染中人類皰疹病毒常見。在所有檢出中,嗜麥芽窄食單胞菌及結核分枝桿菌占比相對較高,這與他人的研究存在差異。觀察發現,在16例檢出嗜麥芽窄食單胞菌的患者中,有8例診斷為重癥肺炎接受RICU治療,5例既往合并2種及以上基礎疾病,大大增加了醫院獲得性感染風險[13]。此外,結核分枝桿菌在免疫低下人群中才易發展為結核病,而糖尿病患者由于體內多項代謝紊亂對人體免疫功能造成影響,增加了其結核易感性[14]。

在糖尿病合并肺部感染患者中mNGS檢測與傳統檢測方法檢測結果的一致性較差,僅有5例檢測到的病原體完全一致,主要為銅綠假單胞菌、馬紅球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、煙曲霉。分析二者一致性較差可能的原因有:(1)mNGS有更廣泛的病原檢測譜,對特殊病原體如曲霉、毛霉、耶氏肺孢子菌、分枝桿菌等具有檢測優勢。(2)mNGS送檢樣本在收集、操作過程中有污染的可能性。因此,對mNGS檢測報告的解讀應與臨床實際相結合。44例傳統檢測陰性但mNGS檢測陽性,相比之下,在傳統培養無法檢測到的病原體,mNGS檢測具有較高的臨床價值。此外,有15例傳統檢測及mNGS檢測結果均陰性,考慮可能原因有:(1)部分患者行病原學檢測之前使用抗生素治療,可能影響病原體的檢出率。(2)所有mNGS標本均送至第三方檢測機構,延長了上機時間,對病原體的檢出有影響。

為進一步了解 mNGS的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值,本研究以臨床最終診斷為金標準進行比較,結果發現,mNGS的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為92.68%、61.90%、90.47%、68.42%。其中mNGS檢測的敏感度高于傳統檢測方法,但特異度較低,這與既往部分研究結果相似[15-16]。此外,Li等[17]研究發現,mNGS對肺部感染診斷的敏感度高于傳統檢測方法,特別是對細菌感染、混合感染、病毒感染和肺孢子蟲感染的檢出率明顯較高。本研究中,mNGS的特異度相對較低,主要是因為本研究以最終臨床診斷為金標準,結合臨床實際判讀導致mNGS的假陽性率增高,從而使得 mNGS的特異度和陽性預測價值相對降低。本研究還表明,兩種檢測方法在鑒定特定真菌感染方面均有其各自的優勢,如在本研究中,傳統檢測方法在檢測白色念珠菌及熱帶念珠菌方面顯示出一定優勢,而mNGS在曲霉屬、毛霉屬的檢出率更高。既往研究表明,糖尿病是曲霉、毛霉等發病的危險因素[18],對于高度懷疑這幾類真菌感染的患者,傳統檢測方法往往難以檢測到或回報結果時間較長,及早行mNGS檢測,有利于及時調整抗感染方案[19]。

分組研究發現,在老年組與非老年組(80.28%vs84.37%,P>0.05)、糖尿病長病程組與糖尿病非長病程組(78.94%vs83.07%,P>0.05)、血糖控制良好組與血糖控制欠佳組(88.00%vs79.48%,P>0.05)mNGS檢測陽性率無明顯差異,但合并肺基礎疾病組與無肺基礎疾病組(93.02%vs73.33%,P<0.05)mNGS的檢測陽性率之間有統計學差異,進一步表明mNGS對合并肺基礎疾病的肺部感染患者病原學檢出有較高的臨床價值。但由于本研究樣本量較少,仍需較大樣本量進一步研究驗證。

本研究亦存在一定的局限性。首先,本研究為單中心回顧性研究,樣本量較小,進一步需要多中心、大樣本、前瞻性臨床研究評估mNGS在2型糖尿病合并肺部感染患者中的應用價值。其次,本研究未對mNGS結果對臨床最終治療決策的影響進行評估。最后,本研究納入的均為進行過mNGS檢測的肺部感染患者,而臨床中尚有大部分患者因經濟情況未行mNGS檢測,故研究本身存在設計上的偏倚,導致感染類型納入并非全面。

綜上所述,mNGS檢測在檢出陽性率方面優于傳統檢測方法,尤其是在真菌、病毒、特殊病原體方面。mNGS也有相應的不足,現階段仍不能替代傳統臨床診斷檢測方法。但在臨床病原學檢測中,可以作為傳統病原學檢測的有效補充,對于肺部感染病因難以判斷或治療效果欠佳的患者,建議盡早行mNGS及傳統病原學檢測,進一步行針對性治療。