王文藝 彭真 楊曉紅 鄔超

飼鴿者肺(pigeon breeders’lung,PBL)是反復吸入鴿子羽毛、皮屑等脫落物后誘發的肺部炎癥反應性疾病[1-2]。其發病依賴于吸入致敏原,致敏原被肺巨噬細胞識別并吞噬,與特異性IgG結合形成免疫復合物,通過補體激活活化巨噬細胞[3-4]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和轉化生長因子(TGF-β1)是肺纖維化的關鍵細胞因子,參與肺纖維化的形成[5]。Notch信號通路是巨噬細胞生物學功能的關鍵調節器,在不同環境刺激下極化為經典活化M1型巨噬細胞和旁路活化M2型巨噬細胞,M1型巨噬細胞增多促進炎癥的進展,M2型巨噬細胞增多促進肺纖維化的進展[6],γ分泌酶抑制劑(DAPT)阻斷Notch信號通路,可直接或間接的影響巨噬細胞的促炎功能及部分炎癥因子的轉錄[7]。課題組前期發現纖維化期Notch信號傳導通路異常表達與巨噬細胞的極化相關,故推測Notch信號通路可能通過調控巨噬細胞極化方向影響纖維化型飼鴿者肺的發展。

資料與方法

一、一般資料

本研究采用的清潔級健康成年SD大鼠(sprague-dawley rat,SD Rat)6～8周齡27只,不限雌雄,(Wt:180～200 g)。所有動物均購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,許可證號[SCXK(滬)2018-0006]。飼養環境:溫度21℃～25℃,相對濕度45%～50%,用標準大鼠箱飼養,2～3只/箱,水料充足,換氣次數1～2次/天,氣流速度0.1～0.2 cm/s,環境噪聲控制在60dB以下,照明15～20lx。檢疫1周后用于實驗。所有操作和實驗流程均遵循《實驗動物管理條例》,已通過新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會審批同意(2019030615)。

二、方法

1 建立疾病模型 正常對照組(Ctrl組)0.9%生理鹽水氣道內滴入1次/周,持續4周,培育至20周;模型組(M組):凍干粉氣道內滴入1次/周,連續4周,將老鼠培育至20周;給予DAPT抑制劑組(M+DAPT組):造模開始給予γ分泌酶抑制劑(DAPT 0.05 mg/kg腹腔注射)干預,每周2次,持續4周,造模結束后每周1次,持續到20周實驗結束,腹腔注射戊巴比妥鈉(10 mg/kg)過麻處死大鼠,留取左肺組織,取右肺肺泡灌洗液備用。

2 肺泡巨噬細胞培養及鑒定 取肺泡灌洗液,按實驗要求調整細胞濃度為1×105個/mL,細胞吹打混勻后,移入鋪有圓形載玻片的24孔板中,置于37℃,5% CO2培養箱中培養2h,用D-hanks液體沖洗,貼壁細胞孔中加入RPMI1640培養基2mL,隔2天進行半量換液,培養7天,得貼壁的巨噬細胞用于以下實驗,免疫熒光檢測CD68鑒定巨噬細胞,分離的巨噬細胞CD68染色陽性,純度達95%以上為合格(見圖1)。

圖1 大鼠肺泡巨噬細胞鑒定免疫熒光圖(×400)

3 Western Blot檢測α-SMA、TGF-β1及Notch信號通路關鍵蛋白的表達 本研究所用電泳系統由Bio-Rad公司出品的Mini-PROTEAN 3(MP3)電泳槽和Mini-PROTEAN 3緩沖液槽及蓋組成,轉膜儀為Bio-Rad公司出品的Trans-Blot SD濕轉轉印槽。取出-80℃冷凍肺組織,20～50mg左右,加緩沖液組織剪碎,研磨,用濾網200目過濾,標本制備成勻漿,用預冷 PBS 洗滌細胞 3 次后加入RIPA細胞裂解液,提取細胞蛋白,BCA 法測定并調整蛋白濃度,進行電泳及轉膜,50g/L 脫脂奶粉封閉2 h后TBST洗膜3次(10 min/次),并按照說明書要求滴加一抗、二抗,進行化學發光反應,對所顯影的蛋白條帶用ImageJ檢測其灰度值,采用于Tanon5200化學發光成像儀拍照,獲取圖片。

4 熒光定量PCR技術檢測阻斷Notch通路對巨噬細胞極化方向的影響 本研究采用TRIzolRNAiso Plus(Takara,9108,即Trizol)法提取細胞總RNA,逆轉錄實驗步驟按照逆轉錄試劑盒說明書操作[PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara,RR047A,即逆轉錄試劑盒),定量PCR根據上述反應體系加入各種反應試劑,是混勻好的試劑,里面有Taq polymerase,dNTP,Sybr green(SYBR?Premix Ex Taq(Takara,RR820A)]染液,反應緩沖液。整個試劑配制體系在冰上配制,根據上述反應體系輕輕混勻后,將8連管用蓋子蓋好后,在離心機中瞬時離心將貼在管壁上的液體沉到底部。將8連管放入定量PCR檢測,采用以上反應體系。PCR反應結束后,直接將8連管丟棄,直接根據儀器收集的數值對數據進行分析即可,引物(見表1)。

表1 巨噬細胞引物標記基因的引物

三、統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行分析,所有定量數據在符合正態分布和方差齊性檢驗后,多組間比較使用單因素方差分析,LSD-t法進行多組樣本均數間的兩兩比較,P<0.05表示其差異存在統計學意義。

結 果

一、動物模型制備

根據預實驗結果20周時大鼠出現纖維化改變,故本研究選取18只纖維化大鼠分為2組,即大鼠飼鴿者肺纖維化模型及DAPT抑制劑干預組,正常對照組9只,采用HE及Masson染色檢測各組大鼠病理變化,Ctrl組肺組織未見炎癥及纖維化改變,M組可見肺間質炎細胞浸潤明顯,細支氣管及腺體周圍纖維組織和平滑肌組織明顯增生,肺泡間隔增寬,肉芽腫及肉芽腫中心纖維化形成。M+DAPT組炎細胞浸潤及纖維化程度明顯減低,未見明確肉芽腫形成(見圖2)。

圖2 三組大鼠肺組織HE染色及Masson染色病理圖表現

二、肺部CT變化

20周時正常對照組肺部影像學未見纖維化形成,大鼠纖維化型飼鴿者肺20周時雙肺可見網格影及部分區域內呈蜂窩樣改變,考慮符合纖維化改變,給予DAPT抑制劑干預后可延緩纖維化形成(見圖3)。

圖3 三組大鼠間肺部影像學表現

三、α-SMA、TGF-β1及Notch信號通路關鍵蛋白的表達結果

與Ctrl組比較:α-SMA纖維化期M組患者α-SMA表達水平較對照組顯著增高(P<0.05);TGF-β1纖維化期M組患者TGF-β1表達水平較對照組顯著增高提示大鼠纖維化型飼鴿者肺造模成功;給予DAPT抑制劑后TGF-β1蛋白表達水平較纖維化期降低,差異有統計學意義,而α-SMA蛋白表達量較纖維化期下降,但差異無統計學意義。M組與Ctrl組比較:纖維化型過敏性肺炎大鼠肺組織Notch信號通路關鍵蛋白配體DLL1、DLL4、JAG1、JAG2及受體Notch1、Notch2的蛋白表達水平增高;應用DAPT抑制Notch信號通路后DLL4、JAG1、JAG2及受體Notch1均下降(P<0.05);而DLL1、Notch2蛋白表達水平下降,差異無統計學意義(見表2及圖4)。

表2 α-SMA、TGF-β1及Notch信號通路關鍵蛋白的表達結果

圖4 三組大鼠間a-SMA、TGF-β1及Notch信號通路關鍵蛋白的表達

四、M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞標記基因的mRNA表達結果

M組與Ctrl組比較:纖維化型過敏性肺炎大鼠肺組織巨噬細胞M1型標記基因TNF-α、iNOS mRNA表達量下降;巨噬細胞M2型標記基因Mrc2、Arg-1 mRNA表達量升高(P<0.05),應用DAPT抑制Notch信號通路后TNF-α、iNOS基因mRNA的相對表達量升高,Mrc2、Arg-1 基因mRNA的相對表達量降低(P<0.05)(見表3和圖5)。

表3 M1型、M2型巨噬細胞標記基因 mRNA表達水平

討 論

前期已在新疆喀什地區“新疆新投鴿葉有限公司”鴿舍內收集的鴿子脫落物成功制作了纖維化型過敏性肺炎動物模型。本研究按照前期研究使用鴿子糞、羽毛、皮屑等脫落提取物制作凍干粉蛋白溶于生理鹽水中,每周一次氣道滴入制作的大鼠動物模型HE染色細支氣管壁增厚纖維化明顯,血管周圍見小灶肉芽腫,腺體增生,肺泡間隔增寬;Masson染色提示肺間質纖維化明顯,橋狀纖維化形成,細支氣管管壁明顯增生纖維化,肺泡腔塌陷,部分消失;文獻提示纖維化型過敏性肺炎通常以細支氣管為中心,可以出現橋接纖維化、小葉周圍或肺膜下纖維化及顯微鏡下蜂窩肺區域。研究表明TGF-β1 和 α-SMA 是關鍵致纖維化因子[8],本研究中纖維化期α-SMA、TGF-β1表達水平增高,表明在成纖維細胞持續性分化增殖的過程中二者協同參與肺纖維化的形成,證實纖維型飼鴿者肺造模成功。

Notch信號通路是高度保守的信號轉導通路,在肺的穩態、損傷和修復中起著關鍵作用[9]。研究發現:纖維化型過敏性肺炎大鼠肺組織Notch信號通路關鍵蛋白配體DLL1、DLL4、JAG1、JAG2及受體Notch1、Notch2的蛋白表達水平增高;應用DAPT抑制Ntoch信號通路后DLL4、JAG1、JAG2及受體Notch1均下降;而DLL1、Notch2蛋白表達水平下降,差異無統計學意義,提示Notch信號通路在纖維化飼鴿者肺中起作用。在文獻中報道巨噬細胞的活化及分化總伴隨著Notch1、Notch2受體表達的增加;在一定范圍內,Notch 信號通路激活促進巨噬細胞的炎癥反應,而巨噬細胞釋放炎癥介質或自身Notch信號通路激活可以使 Notch受體、配體表達增加[10-12]。Notch信號的抑制因子DAPT能夠以一種時間和劑量依賴模式抑制CD4+T淋巴細胞的增殖,阻斷肺泡上皮細胞發生上皮-間充質轉化(EMT),延緩肺纖維化發生、發展。

不同的病理條件下,Notch通路可以決定巨噬細胞的M1/M2激活模式[13]。本研究結果表明:纖維化型過敏性肺炎大鼠肺組織巨噬細胞M1型標記基因TNF-α、iNOS mRNA較正常對照組比較表達量下降;巨噬細胞M2型標記基因Mrc2、Arg-1 mRNA表達量升高(P<0.05),表明予以致敏原刺激后,大鼠纖維化型飼鴿者肺中巨噬細胞向M2方向極化,應用DAPT抑制劑后TNF-α、iNOS基因mRNA的相對表達量升高,Mrc2、Arg-1 基因mRNA的相對表達量降低,表明M2型極化發生了減少,巨噬細胞向M1型方向極化;表明Notch信號通路存在使巨噬細胞易于向M1型分化,當DAPT抑制劑阻斷信號通路時,抑制巨噬細胞向M2型分化;而我們在飼鴿者肺纖維化型大鼠動物模型中也發現了這一特點,與Ye C,Li H等人在急性肺損傷中研究的巨噬細胞極化方向結果一致[14]。表明M2巨噬細胞可以產生促纖維化介質,促進肌成纖維細胞增殖[15]。而本研究中大鼠已經處于肺纖維化狀態,且表現出巨噬細胞向M2型極化增多的現象,表明飼鴿者肺纖維化型的大鼠動物模型中巨噬細胞向M2型極化受Notch信號通路抑制劑DAPT的影響。

從本實驗我們看到Notch信號通路可能調控巨噬細胞極化參與大鼠纖維化型飼鴿者肺發生發展,實驗研究本就是在摸索中前進,后期我們會探討巨噬細胞敲除后纖維化型飼鴿者肺的關系進一步闡明纖維化型過敏性肺炎的免疫學機制。