研究TGR5過表達對暴露于高氧的新生小鼠炎癥和肺損傷的影響

池婷 劉愛紅 范彧 陰欣

支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是一種早產兒慢性肺部疾病[1],由補充供氧或機械通氣治療呼吸窘迫綜合征引起[2]。肺泡簡化是肺中與BPD相關的主要病理改變,影響有效氣體交換和肺功能[3-4]。BPD不僅會降低新生兒的肺功能[5],還會增加兒童后期患哮喘的可能性[6]。因此,預防或改善BPD對新生兒來說很重要。跨膜G蛋白偶聯受體-5(takeda G protein-coupled receptor-5,TGR5)是一種血漿膜結合G蛋白偶聯膽汁酸受體,在人體各器官中廣泛表達[7]。研究表明,TGR5可以改善肝臟損傷中的炎癥反應[8],也有利于預防高糖誘導的心肌細胞損傷[9]。盡管在肺中也發現了TGR5的表達,然而TGR5對高氧(hyperoxia,HO)誘導的BPD的保護作用尚未見報道。本研究旨在確定TGR5對新生小鼠BPD炎癥和肺損傷影響,并評估潛在的分子機制。

資料與方法

一、材料

1 主要試劑 慢病毒(LV-TGR5、LV-NC、si-TGR5和si-NC)購自上海生工生物公司;髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性分析試劑盒購自南京建成生物公司;ELISA試劑盒購自武漢云克隆生物公司;抗體購自英國Abcam公司。

2 實驗動物 C57BL/6小鼠(6～8周齡,20～24 g)購自山西醫科大學(生理動物實驗室)。許可證號:SYXK(晉)2019-0008。所有動物實驗均按照美國國立衛生研究院的實驗動物護理和使用指南進行,并得到了山西省兒童醫院動物倫理委員會的批準(NO.2022056)。所有小鼠飼養在20℃～24℃的單個籠子中,在12h/12h的光/暗循環中自由獲取食物和水。

二、方法

1 動物模型及分組 將成年小鼠雜交并在足月(妊娠第21～22 天)自然分娩,幼崽被匯集,并在6小時內返回母鼠。將36只幼鼠分為6個實驗組(n=6):對照組(常氧組);高氧組(HO組);HO+LV-NC組;HO+LV-TGR5組;HO+si-NC組;HO+si-TGR5組。在整個實驗過程中,HO+LV-TGR5組和HO+si-TGR5組小鼠以25 mg/kg的劑量分別靜脈注射[10]慢病毒感染載體,每兩天一次。對照組和HO組注射等體積的生理鹽水。對照組的新生小鼠被放置在含21%氧氣的室內空氣中,HO組的新生小鼠被放置在含75%氧氣的一個密封的有機玻璃室內14天[11],濕度和環境溫度分別保持在50%和24℃。對照組與HO組母鼠每24 h在高氧和常氧窩之間輪轉,以防止O2毒性。房間每天打開一次,持續0.5 h,以替換食物和水。實驗期間每天觀察各組新生小鼠的存活情況。每組小鼠分別于出生后14天腹腔注射1%戊巴比妥(50 mg/kg)處死。收集肺組織、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和血清進行形態學測定和生化分析。

2 蘇木精-伊紅(hematoxylin&eosin,H&E)染色 處死小鼠并結扎右支氣管。左肺通過靜脈注射針插入氣管在20 cm H2O壓力下灌注4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)。左肺用4% PFA固定48 h后,切片用石蠟包埋并切片成4 μm厚度。切片用蘇木精和伊紅(H&E)染色,用光學顯微鏡(日本Nikon公司)進行形態測量分析。

3 肺濕/干(W/D)比測量 從小鼠體內對濕肺組織進行分離,記錄肺組織的濕重,在80℃下干燥48 h并重新稱重,直到達到穩定的干重。然后計算肺W/D重量比。

4 支氣管肺泡灌洗液分析 出生14天后處死幼鼠,在H&E染色處理左肺之前,通過氣管插管用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次,收集洗滌液,在4℃下12000 rpm離心15 min。收集上清液,使用BCA蛋白檢測試劑盒(北京碧云天公司)測定蛋白濃度。使用Countstar 自動細胞計數器(上海瑞宇生物公司)計數總細胞。用瑞氏吉姆薩染色的離心制劑進行差異細胞計數,每只幼鼠至少計數200個細胞。

5 髓過氧化物酶活性分析 取新鮮肺組織,濾紙吸干污血滲液后,在適當比例的生理鹽水中均質。將樣品在4℃下12000 rpm離心20 min,使用指定的MPO活性比色分析試劑盒在460 nm下測定上清液中的MPO活性。

6 血清細胞因子水平 按方法4處理收集上清液。根據制造商的說明,使用細胞因子特異性ELISA試劑盒測量腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-10的水平;使用微孔板讀數器在450 nm處對結果進行定量。

7 SOD,GSH和MDA測定 按方法4處理收集上清液。按照制造商說明,使用市售的診斷試劑盒(北京碧云天公司)評估丙二醛(malondialdehyde,MDA)濃度,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性。

8 qRT-PCR實驗 使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)從組織提取總細胞RNA,并用于合成cDNA(日本Takara公司)。使用Fast Start Universal SYBR Green Master(日本Takara公司)和7900實時PCR系統(美國Applied Biosystems公司)按照94℃ 25 s,94℃ 7 s和58℃ 25 s循環38次進行定量PCR。使用2-△△Ct方法計算基因水平。小鼠TGR5正向引物 5′-CCTGGCAAGCCTCATCGTC-3′,TGR5反向引物5′-AGCAGCCCGGCTAGTAGTAG-3′; 小鼠β-actin正向引物 5′-ATGGAGCCGGACAGAAAAGC-3′,β-actin反向引物 5′-TGGGAGGTGTCAACATCTTCTT-3′。

9 Western Blot分析 收集肺組織樣本并使用RIPA緩沖液(北京碧云天公司)進行裂解。通過低溫離心(1000×g,10 min)獲得蛋白質,并使用BCA蛋白檢測試劑盒(美國Thermo Fisher公司)確定濃度。蛋白質在10%～12%的SDS/PAGE凝膠上分離,并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的脫脂牛奶封閉1 h后,在4 ℃環境下孵育抗TGR5、磷酸化p65、p65和乙酰化p53過夜。TBST洗滌3次后,將膜與辣根過氧化物酶偶聯的二抗在室溫下孵育1 h。用β-actin作為內參對照蛋白。使用增強化學發光檢測系統檢測蛋白條帶,并用Multi-Analyst software package (美國Bio-Rad公司)對條帶密度進行定量。

三、統計學分析

結 果

一、TGR5在新生高氧肺損傷小鼠中上調

構建了HO誘導的小鼠BPD模型,新生小鼠出生14天后收集小鼠肺組織進行組織學檢查和基因檢測。與對照組相比,HO組間質水腫和肺泡壁增厚,中性粒細胞和巨噬細胞浸潤。此外,與對照組相比,HO組小鼠肺組織中TGR5的表達顯著上調(P<0.05)(見圖1)。

圖1 TGR5在HO小鼠中上調

二、TGR5過表達減弱HO誘導的新生小鼠肺損傷

為了探究體內TGR5表達在新生小鼠肺發育的功能意義,通過靜脈注射LV-TGR5或si-TGR5載體,并建立新生小鼠BPD模型。與HO組相比,LV-TGR5明顯增加TGR5表達,si-TGR5明顯降低TGR5表達(P<0.05)。與對照組相比,HO組間質水腫和肺泡壁增厚,中性粒細胞和巨噬細胞浸潤明顯;肺含水量明顯增加;BALF中總細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數量明顯增加(P<0.05)。與HO組相比,TGR5過表達組新生小鼠水腫和肺泡壁增厚減弱,中性粒細胞和巨噬細胞浸潤減少;肺含水量明顯減少;BALF中總細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數量明顯減少(P<0.05)。與HO組相比,TGR5干擾進一步加劇肺泡損傷惡化,明顯增加肺含水量,增加BALF中總細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數量(P<0.05)(見圖2)。

圖2 TGR5過表達對肺組織損傷的影響

三、TGR5過表達減輕HO誘導的肺氧化應激

與對照組相比,HO組的促氧化應激標記物MDA含量顯著升高,抗氧化應激標記物GSH和SOD活性降低(P<0.05)。與HO組相比,TGR5過表達顯著降低MDA含量,升高GSH和SOD活性(P<0.05)。與HO組相比,TGR5干擾進一步升高MDA含量,降低GSH和SOD活性(P<0.05)(見圖3)。

圖3 TGR5過表達對BPD小鼠氧化應激的影響

四、TGR5過表達減少HO誘導的中性粒細胞浸潤和炎癥因子釋放

與對照組相比,HO組的肺MPO活性顯著增加(P<0.05);血清中TNF-α和IL-6表達顯著增加,IL-10表達顯著減少 (P<0.05)。與HO組相比,TGR5過表達顯著抑制MPO活性;降低TNF-α、IL-6表達,升高IL-10表達(P<0.05)。與HO組相比,TGR5干擾顯著升高MPO活性;升高TNF-α和IL-6的血清表達,降低IL-10的血清表達(P<0.05)(見圖4)。

圖4 TGR5過表達對BPD小鼠炎癥反應的影響

五、TGR5過表達抑制TRAF6/NF-κB信號通路的活化

與對照組相比,HO顯著升高肺組織中TRAF6和p65的蛋白表達(P<0.05)。與HO組相比,TGR5過表達顯著降低TRAF6蛋白表達和p65磷酸化水平(P<0.05)。與HO組相比,TGR5干擾進一步升高TRAF6和p65的蛋白水平(P<0.05)(見圖5)。

圖5 TGR5對小鼠肺中TRAF6/NF-κB通路的影響

討 論

BPD是早產兒常見的臨床并發癥。據報道,未成熟的肺長期暴露于高氧環境中是BPD發生發展的主要原因之一[12],并一直延伸到患有嚴重呼吸系統問題的兒童時期。我們通過將小鼠暴露于75%的氧氣中,建立了新生小鼠的BPD模型。本研究中,我們證實了新生小鼠持續暴露于HO導致BPD病理特征。TGR5過表達減弱了HO誘導的中性粒細胞浸潤和氧化應激,并改善間質水腫和肺泡壁增厚,減少肺部炎癥。

高氧暴露肺損傷是BPD新生兒最常見的肺損傷模式,可引起肺泡簡化、血管畸形和肺纖維化。出生后0～14天將新生小鼠暴露在75%的氧氣中,這代表小鼠的囊泡和肺泡階段。此外,暴露于高水平的氧氣中不可避免地會導致產生過量的氧自由基[13]。MDA作為脂質過氧化的產物,可用于評估氧化應激水平,而抗氧化酶SOD和抗氧化劑GSH在氧化應激中發揮重要作用,可清除超氧陰離子自由基,保護細胞免受HO損傷[14]。在隨后發展為BPD的早產兒中檢測到較低的抗氧化水平和較高的MDA濃度[15]。在本研究中,HO暴露后,新生小鼠肺組織MDA升高,GSH和SOD減少,肺結構破壞,炎癥細胞浸潤,表明高氧誘導的肺損傷模型成功建立。TGR5過表達使BPD小鼠的氧化應激和HO誘導的肺損傷得到改善。TGR5過表通過提高GSH和SOD水平表現出抗氧化作用,降低了HO誘導的脂質過氧化程度,提示TGR5過表達緩解了HO誘導的新生小鼠肺氧化應激。

肺部炎癥加重BPD的發展,炎癥因子與BPD的不良結局相關[16]。本研究中,ELISA結果顯示,TGR5過表達可降低小鼠血清中HO誘導的TNF-α、IL-6血清水平,升高IL-10水平,提示TGR5過表達可有效緩解高氧損傷引起的炎癥反應。Leroy等[17]指出,BPD患兒的全身炎癥先于臨床癥狀。TGR5過表達對HO誘導血清炎癥因子水平的抑制作用,提示其可用于BPD的早期干預。TRAF6蛋白是腫瘤壞死因子受體相關因子(TNF receptor associated factor,TRAF)家族成員之一,與敗血癥引起的急性肺損傷密切相關[18]。研究表明,TRAF6的過度表達增加了TNF-α和IL-6的表達水平[19]。NF-κB通路參與廣泛的炎癥激活。先前的研究表明,TRAF6可以激活NF-κB信號通路[20],而抑制NF-κB通路可減輕LPS誘導的急性肺損傷[21]。在本研究中,我們發現HO暴露促進NF-κB通路的激活,這可能與HO誘導的肺損傷和炎癥有關。TGR5過表達降低了高氧誘導的TRAF6蛋白和NF-κB p65的磷酸化,提示TGR5過表達可能通過抑制TRAF6/NF-κB信號通路活性來緩解小鼠肺損傷,但仍需進一步研究。

綜上所述,本研究證實在小鼠BPD模型中,TGR5可以減少肺泡水腫和氧化應激反應,改善肺功能和降低炎癥細胞浸潤。TGR5可以通過抑制肺細胞中TRAF6/NF-κB通路降低高氧肺損傷的嚴重程度。我們的結果為保護高氧肺損傷提供了一種新的機制,為預防炎癥反應和新生兒BPD提供一種新的、潛在的治療方法。