煤礦復墾區不同恢復年限沙棘人工林土壤細菌群落結構與功能預測

同曉冬, 楊妮, 秦家鳳, 劉廣全, 艾寧,, 劉長海*

(1.延安大學生命科學學院, 延安 716000; 2.中國水利水電科學研究院, 北京 100038)

中國是煤炭開采量全球最高的國家[1],大量煤礦資源的開采,滿足了經濟建設需要的同時也嚴重擾動了區域的自然生態系統,尤其是采礦導致的土壤損毀、土壤污染及水土流失問題[2]。目前,礦產資源的開采所引發的生態問題已上升為世界問題,各國學者及政府對此給予了廣泛的關注,并進行了深入研究[3-5]。中國在該方面的研究較晚且對礦區的修復率不足,這不利于區域社會經濟發展和環境安全[6]。排土場是露天煤礦開采造成土壤損毀的主要表現形式之一,該區域土壤動植物多樣性低下,土壤養分減少,土壤功能下降[7],因此對其進行復墾已成為礦區生態修復與重建的關鍵,對于礦區的可持續發展具有重要意義。

土壤復墾對土壤環境產生影響,進而推動土壤微生物群落的變化。土壤微生物是土壤生物區系中的重要組成部分,可參與有機物質的分解和礦化,腐殖質形成,土壤養分轉化及循環,促進生物地球化學循環[8-9],是連接地上與地下部分的重要環節,向上促進植被的定植和生長,向下維持土壤的結構及理化性質的穩定性[10]。土壤細菌是土壤微生物中最豐富的部分,參與土壤系統中大多數的養分轉化[11-12],對土壤微環境變化敏感,可短期內快速對環境變化產生反應,其群落結構和功能的變化可指示植被群落的演替和土壤肥力的改變[13-14],因此,應用微生物群落特征來評估礦區土壤健康及生態修復效果已成為中外學者研究的熱點問題[15]。張小玲等[16]對不同復墾年限煤矸山的功能細菌進行研究,發現復墾年限的增加促進了功能菌總量的增加,速效磷、含水量和堿解氮是影響功能菌的主要因子。馬守臣等[17]研究了山西長治司馬礦煤矸石填埋場土壤微生物學特性的時空變異,表明各土層微生物數量和真菌、放線菌的豐度隨復墾年限逐漸增加。Li等[18]評估了復墾對黃土高原不同植被類型土壤微生物及酶活性的影響,發現土壤有機碳是影響土壤微生物群落和酶活性的主要因素,微生物多樣性在混交林土壤中最高,復墾對微生物豐度、多樣性和組成的影響在各個植被類型存在差異。

Plassart等[19]對法國北部粉砂田研究表明,草地恢復可逐漸增加微生物量和微生物活性,對保持土壤狀況有積極影響。陳熙等[20]對贛州-安遠稀土棄廢尾礦進行研究,結果顯示,經不同的植被修復后,原尾礦土壤理化性質改善明顯,土壤微生物結構發生改變且土壤微生物多樣性、豐富度、均勻度均得到顯著的提高。Garaiyurrebaso等[21]在礦區選擇兩個被重金屬嚴重污染的植被場地,分析了使用幾種不同改良劑5 a后的微生物生物量、多樣性等指標,結果表明,造紙廠污泥與雞糞混合處理后,鎘、鉛和鋅的生物有效性降低幅度最大,并刺激了土壤微生物活性和多樣性,土壤質量大幅提高。但以上研究多集中于植被對微生物生物量、群落組成及結構的影響,少見于植被不同恢復年限土壤微生物功能的研究,更鮮見于連續恢復年限對土壤微生物結構和功能的影響,而研究土壤微生物功能對于揭示其在土壤生態系統修復中的作用具有重要意義[22-23]。目前,隨著分子生物技術的快速發展,PICRUSt作為一種預測細菌代謝功能的新算法已被廣泛應用于海洋、湖泊、土壤領域的細菌功能分析中并取得了顯著成效[24-25]。這是一種基于高通量測序程序,將得到的16S rRNA基因與數據庫中已知代謝功能的細菌基因序列進行比對,從而對細菌進行預測的一種方法[26],為對細菌功能的深入認識提供了新途徑。

基于此,本研究以鄂爾多斯聚鑫龍煤礦復墾區3～7 a恢復年限(連續年份)沙棘人工林為研究對象,采集研究區土壤樣品,應用Illumina高通量測序技術和PICRUSt算法對土壤樣品中的細菌群落結構、多樣性和功能進行分析,并揭示土壤細菌與土壤理化性質之間的關系,以期為研究區礦區土地復墾與環境修復提供數據支撐與科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于內蒙古自治區鄂爾多斯市的聚鑫龍煤礦(110°4′2″E,39°54′16″N),地勢平坦,海拔約1 260 m,水蝕風蝕嚴重,屬溫帶大陸性氣候區,全年無霜期約135 d, 年均溫7.5 ℃,年均降水量400 mm,集中于7—9月。研究區于2011年開始造林進行礦區生態修復建設,主要種植大果沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.cv)。樣地概況如表1所示。

表1 樣地概況

1.2 樣地設置與樣品采集

在研究區選取恢復年限為3～7 a的沙棘林作為研究對象,并以撂荒草地做對照進行土壤樣品的采集。各采樣區布設20 m × 20 m的固定樣地,每個樣地設置1 m×1 m的3個樣方,每個樣方按“S”形5點法進行取樣,如圖1所示。用土鉆(直徑5 cm、高20 cm)進行垂直取樣,取樣深度為10 cm。將5份土樣放在油布上混合均勻,去除其中的枯落物等雜物后過2 mm土篩,取2份土樣,每份土樣500 g,一份于無菌袋放入干冰盒內,將其置于-70 ℃冰箱中保存用于微生物DNA提取及高通量測序;另一份于塑封袋中帶回實驗室,自然風干后進行理化性質的測定。

圖1 樣地及采樣基本情況圖Fig.1 Sample plot and basic sampling situation diagram

1.3 樣品測定

1.3.1 土壤基本特性

土壤理化性質的測定依照《土壤農化分析》[27]進行:土壤pH用酸度計法測定,有機質用重鉻酸鉀容量法,堿解氮采用堿解擴散法,全磷用鉬銻抗法,速效鉀用NH4OAC浸提-火焰光度法,土壤含水量依據《土壤物理性質測定方法》[28]中的環刀浸提法進行測定。

1.3.2 土壤細菌高通量測序

土壤樣品總DNA的提取采用E-Z 96 Mag-Bind Soil DNA Kit(M5636-02,Omega,CA,USA)試劑盒進行,取0.5 g新鮮土樣,按照試劑盒說明書進行具體操作。細菌的V3V4的擴增引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR的反應體系包括:DNA模板1 μL,上游引物和下游引物 (10 μmol/L) 各1 μL,Fast pfu DNA聚合酶0.25 μL,2 μL的dNTP(2.5 mmol/L),超純水(ddH2O)14.75 μL,共25 μL。擴增條件為:98 ℃預變性5 min,28個循環(98 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s),最后72 ℃延伸5 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物,用磁珠對產物進行純化后進行熒光定量,熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit,定量儀器為Microplate reade (BioTek,FLx800)。根據熒光定量結果,按照每個樣本的測序量需求,對各樣本按相應比例進行混合。產物委托上海派森諾生物科技有限公司進行高通量測序。高通量測序得到的數據用Vsearch軟件分析流程進行質量過濾,拼接和嵌合體的去除。對得到的高質量序列進行OTU類分析,基于OTU聚類的結果,之后用QIIME2 (2019.4)分析軟件對物種分類及生物多樣性指數進行分析。

1.4 數據分析

采用Excel 2010和SPSS 22.0軟件對土壤理化性質及細菌群落組成數據進行處理,應用單因素方差分析(ANOVA)和多重比較法(Duncan)進行數據顯著性差異分析。PICRUSt基因功能預測由派森諾生物公司進行,細菌群落冗余分析在軟件Canoco 5.0中完成,其余圖形繪制均采用Origin 2021和R4.1.2軟件完成。

2 結果分析

2.1 土壤基本性質

不同恢復年限沙棘林土壤基本性質如表2所示,研究區土壤偏堿性,pH變化范圍處于7.47～8.29;土壤有機質隨恢復年限增長呈先減小后顯著增大的趨勢,恢復7 a 時土壤有機質最大,且高于草地有機質含量;堿解氮和全磷的平均值分別為9.31 g/kg和0.48 g/kg,二者的最大值都出現在恢復年限6 a;速效鉀和水分的平均值分別為81.53 g/kg和6.76 g/kg,速效鉀的最大值出現在最大恢復年限7 a,水分的最大值出現在恢復年限3 a。

表2 土壤理化指標

2.2 不同恢復年限土壤細菌群落結構

2.2.1 土壤細菌群落組成

不同恢復年限沙棘人工林土壤樣品共檢測到細菌29門、91綱、193目、305科和438屬,在門分類水平上(圖2),各樣地以放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)為優勢菌門,擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Patescibacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、藍藻門(Cyanobacteria)為常見菌門,以上菌門在各樣地中總占比達到80%以上,但各個菌門分布存在差異。放線菌門在樣地3 a中為第二優勢菌門,而在其他樣地均為第一優勢菌門,且在各樣地中的比例也存在差異,在5 a最高,7 a最低。

Actinobacteria為放線菌門; Proteobacteria為變形菌門; Bacteroidetes為擬桿菌門; Acidobacteria為酸桿菌門; Chloroflexi為綠彎菌門; Patescibacteria為浮霉菌門; Verrucomicrobia為疣微菌門; Cyanobacteria為藍藻門;Genunatimonadetes為芽單胞菌門; Deinococcus-Thermus為異常球菌-棲熱菌門; Firmicutes為厚壁菌門; Planctomycetes為浮霉菌門; Nitrospirae為硝化螺旋菌門; Armatimonadetes為裝甲菌門; Rokubacteia為己科河菌門; Fibrobacteres為纖維桿菌門; Chlanydiae為衣原體門; Elusimnicrobia為迷蹤菌門

圖3為細菌屬水平上豐度前20個屬的相對豐度。就整個研究區而言,無優勢類群,常見類群為不動桿菌屬(Acinetobacter)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides),二者在各恢復年限樣地中總占比為6.09%。其次為韓國生工菌屬(Kribbella)、康奈斯氏桿菌屬(Conexibacter)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)等稀有類群。不同恢復年限土壤細菌類群相對豐度存在差異。類諾卡氏菌屬為恢復年限4、5、6、7 a沙棘林中相對豐度最高的菌群,不動桿菌屬為恢復年限3 a沙棘林的優勢類群且其相對豐度顯著高于草地土壤。其他稀有類群隨著人工林恢復年限的延長波動變化明顯。Thermus、Deinococcus菌屬相對豐度隨恢復年限延長逐漸降低,CL500-29 marine group、Streptomyces菌屬相對豐度則逐漸增加。

Acinetobacter為不動桿菌屬; Nocardioides為類諾卡氏菌屬; Kribbella為韓國生工菌屬; Conexibacter為康奈斯氏桿菌屬; Brevundimonas為短波單胞菌屬; Therrmus為棲熱菌屬; Deinococcus為異常球菌屬; Herpetosiphon為滑柱菌屬; Patulibacter為散生桿菌; Spirosoma為螺狀菌屬; Rubrobacter為紅色桿菌屬; Actinomycetospora為放線胞菌屬; Hymnenobacrer為薄層菌屬; Psendomonas為假單胞菌屬; Streptomyces為鏈霉菌屬

2.2.2 土壤細菌群落差異性分析

為了進一步了解不同生境群落物種組成的組間差異性及相似性,因此進行了β-多樣性分析?；贐ray-Curtis距離算法,采用 PCoA 分析不同恢復年限沙棘林土壤細菌群落組間差異(圖4)。由圖4可知,PC1解釋了樣品差異的27.2%,PC2解釋了樣品差異的23.9%,二者共同解釋了物種分布差異的51.1%。PC1可明顯將恢復年限3、4 a的細菌群落與5、6 a分開,PC2可明顯將恢復年限3、4、7 a的細菌群落與5、6 a、草地分開。整體而言,恢復年限3、4 a的細菌群落結構較為相似,而5、6、7 a及草地的細菌群落較為相似,其中草地細菌群落與恢復6a的沙棘林最為相似。可見,恢復年限較短的細菌群落與較長年限的細菌群落差異性較大,恢復年限較長的沙棘林與撂荒草地細菌群落結構相似性較大。

圖4 不同恢復年限沙棘林土壤細菌群落PCoA分析Fig.4 PCoA analysis of soil bacterial communities in seabuckthorn forest with different restoration years

2.3 細菌群落與土壤環境因子的相關性

為探討土壤環境因子對土壤細菌群落組成的影響,對土壤細菌屬水平群落與土壤理化性質進行冗余分析(RDA),如圖5所示。第一排序軸解釋了細菌群落相對豐度變化的39.89%,第二軸解釋了細菌群落變化的32.72%,二者共同解釋了細菌群落變化的72.61%。不動桿菌屬(Acinetobacter)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)與土壤pH和土壤含水量呈顯著正相關關系,與土壤有機質呈顯著負相關關系;鏈霉菌屬(Streptomyces)、Subgroup10菌屬、RB41菌屬、Haliangium菌屬與土壤堿解氮和速效鉀含量呈顯著正相關;康奈斯氏桿菌屬(conexibacter)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、韓國生工菌屬(Kribbella)、紅色桿菌屬(Rubrobacter)與土壤有機質呈顯著正相關,與土壤pH、含水量和速效鉀顯著負相關。土壤pH和速效鉀是影響研究區土壤細菌群落結構的主要影響因子。

圖5 主要細菌類群與土壤環境因子的RDA分析Fig.5 RDA analysis of major bacterial groups and soil environmental factors

2.4 土壤細菌PICRUSt功能預測

為了解不同恢復年限人工林土壤細菌代謝功能,采用PICRUSt軟件進行菌群預測(圖6)。基于KEGG 數據庫,在一級代謝通路層對比共得到6類生物功能:代謝(metabolism)、基因信息處理(genetic information processing)、細胞進程(cellular processes)、環境信息處理(environmental information processing)、人類疾病(human diseases)和生物體系統(organismal systems)。其中,代謝、基因信息處理和細胞進程為主要功能,占比分別為82.00%～83.56%,10.06%～11.59%和3.26%～3.88%。與草地相比,沙棘林土壤細菌代謝、環境信息處理、人類疾病、生物體系統4種功能基因豐度較高;且隨恢復年限的增加,基因信息處理、細胞進程、人類疾病、生物體系統功能基因呈波動增長趨勢。

圖6 不同恢復年限土壤細菌基因功能預測(一級功能)Fig.6 Prediction of soil bacterial gene function at different restoration years (level 1 function)

二級功能預測表明,沙棘林土壤和草地土壤均存在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、能量代謝、信號轉導、膜運輸、細胞生長和死亡、免疫系統等35個子功能(圖7)。其中,碳水化合物代謝(13.01%～13.87%)、氨基酸代謝(13.13%～13.46%)、輔因子和維生素代謝(10.42%～11.72%)為主要功能。與草地相比,沙棘林土壤膜運輸、信號傳導、癌癥、傳染病功能基因豐度較高,轉錄、氨基酸代謝、其他氨基酸的代謝和萜類和聚酮的代謝基因豐度較低。其中,折疊、分揀和降解、復制和修復、轉錄、神經變性疾病、萜類和聚酮的代謝、核苷酸代謝功能基因豐度隨恢復年限增長而增加,其他氨基酸代謝、外源生物降解和代謝、內分泌系統、環境適應功能基因豐度隨恢復年限增長而減小。

3 討論

3.1 恢復年限對沙棘林土壤理化性質的影響

沙棘屬于復合型根系,低耗水、萌蘗能力極強的固氮植物[29-31],連續種植使區域土壤理化性質發生改變。沙棘可短期內迅速提高土壤有機質含量及土壤養分[32]。研究發現,隨恢復年限的增加,土壤有機質顯著增加(P<0.05),這與張偉華等[33]、常麗等[34]的研究結果相似,這可能是因為沙棘屬于落葉灌木且根系發達,林下凋落物及植物根系殘體隨恢復年限積累,經腐殖化作用使土壤有機質含量不斷增加[35]。土壤堿解氮含量隨恢復年限增加呈先增加后減小的趨勢,這可能是因為在復墾前中期(3～6 a),沙棘根系被根瘤菌侵染形成共生結構,隨恢復年限的延長瘤塊不斷趨于成熟,因而固定到土壤中的氮素也隨之增加[36],而后氮素含量又減小可能是因為植物生長發育的需求量較大。與土壤有機質和堿解氮變化規律不同,土壤水分含量隨恢復年限的延長逐漸減少,這是因為隨著林齡的增大,植被耗水量急劇增加,因此土壤含水量不斷下降[37]。在干旱半干旱地區植被生長所需水分主要來自于大氣降水,土壤對水分的調控能力很差,因此,恢復年限為6 a沙棘林應采取平茬[38]等措施,從而減少林分對土壤水分的不利影響,促進沙棘林的更新和健康發展。

3.2 恢復年限對沙棘林土壤細菌群落結構的影響

森林植被類型、恢復年限是影響土壤細菌群落的主要因素[39-40]。不同植被地表凋落物數量和質量、地下根系的結構、分泌物的不同,造成土壤微生境存在異質性,使土壤細菌組成及數量等發生改變[41-42]。研究發現,在門分類水平上,沙棘人工林和撂荒草地土壤細菌物種組成相似,均以放線菌門、變形菌門為優勢菌門,擬桿菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、疣微菌門、藍藻門為常見菌門,但各菌群豐度存在差異。變形菌門以土壤中甲烷、氨氣等滿足自身代謝,喜好富營養土壤[43]。沙棘土壤變形菌門豐度顯著高于草地,說明沙棘林的建植有利于土壤有機質及土壤養分的提高。隨著恢復年限的延長,變形菌門豐度呈現先減少后增加的趨勢,且在恢復期3 a時豐度最大,這可能是因為土壤酸堿度對細菌的影響較大,而變形菌門更適宜生存于堿性土壤環境[44],3 a時土壤pH最大,而后先減小后增加。放線菌門生態幅較寬,在不同生態系統中多以優勢菌群出現。在本研究中,沙棘林放線菌門相對豐度隨著恢復年限的延長呈現先增加后減少的趨勢,且在恢復年限第5年時顯著高于草地。放線菌在木質素、纖維素、動物殘體等的降解和轉化方面具有重要作用[45]?；謴湍晗薜?年時草地土壤C、N含量遠低于沙棘林,這可能是其放線菌門相對豐度低于沙棘林的原因。6 a開始沙棘林土壤中放線菌門含量逐漸下降,可能是因為沙棘林開始退化,種間競爭激烈而開啟自毒功能,土壤中可利用資源減少從而對細菌產生不利影響。 在屬分類水平上,沙棘林土壤不動桿菌屬、類諾卡氏菌屬相對豐度整體高于草地,這可能是植被類型不同的原因。不動桿菌屬、類諾卡氏菌屬等可通過產生抗生素對植物病原菌產生拮抗作用[46-48]。而沙棘具有龐大的根系,隨著恢復年限的延長,其根系分泌的有機酸等物質不斷積累[49],在化感作用的影響下,某些物質可能有利于增加對病原菌有拮抗作用的有益菌群的活性,與有益菌群產生協同拮抗效應[50]。長期種植沙棘使土壤中的棲熱菌屬(Thermus)、奇球菌屬(Deinococcus)相對豐度逐漸減小。 棲熱菌屬和奇球菌屬間具有非常相近的親緣關系,二者均對干燥、紫外線、強氧化劑等各種惡劣環境有極強的抵抗力[51],隨著恢復年限的延長,土壤環境改善,因此二者含量逐漸減少。另外,二者均與有機質、堿解氮、速效鉀呈顯著負相關,再次說明了其更適宜生活在低營養的貧瘠土壤中。因此,在一定程度上,可以把棲熱菌屬和奇球菌屬作為指示物種,通過其在土壤中含量的變化來表征生境的土壤健康狀況。

3.3 恢復年限對沙棘林土壤細菌基因功能的影響

植被通過影響地上與地下部分影響細菌群落結構,進而對細菌功能產生影響[52]。對人工林和草地土壤細菌基因進行PICRUSt功能預測顯示,研究區土壤細菌主要有代謝、基因信息處理、細胞進程、環境信息處理、人類疾病和生物體系統5個一級功能,以及碳水化合物、氨基酸代謝、脂質代謝、能量代謝和信號傳導等35個二級功能,細菌生態功能較豐富。其中,細菌代謝功能尤為突出,這與王曉菲等[53]的研究結果一致。其二級功能中碳水化合物代謝的通過糖酵解等過程產生的能量與代謝產物有利于植物和細菌的生長和發育[54]。另外,碳水化合物代謝與植物體內所需的氮、磷元素緊密相關,對促進植物氮磷循環有積極作用[55]。氨基酸代謝有利于細菌個體對氨基酸的吸收利用,并可參與多種重要的生理過程,有益于細菌的生存和增殖[56]。部分細菌類群如不動桿菌屬、類諾卡氏菌屬等自身代謝可產生抗生素、生長激素、抗菌蛋白等對植物病原菌產生拮抗作用,促進植物生長。研究區沙棘林各恢復年限間土壤細菌代謝功能差異不明顯,但均高于草地,說明沙棘人工林的建植有利于細菌各代謝功能的提升,從而對植被自身生長起到積極作用。隨著恢復年限的延長,折疊、分揀和降解、復制和修復、轉錄等細菌功能基因豐度逐漸增加,而氨基酸代謝、外源生物降解和代謝、內分泌系統、環境適應功能基因豐度逐漸減小,這可能與植被恢復過程中氣候、土壤、生物因素變化有關。

4 結論

(1)與草地相比,沙棘人工林的建植使土壤有機質、堿解氮、速效鉀、含水量呈增加趨勢,土壤pH和全磷變化不明顯。

(2)研究區共檢測到細菌29門、91綱、193目、305科和438屬,門分類水平上優勢類群為放線菌門、變形菌門;屬分類水平上無優勢類群,常見類群為不動桿菌屬、類諾卡氏菌屬。

(3)沙棘林土壤細菌不動桿菌屬、類諾卡氏菌屬相對豐度整體高于草地;隨著恢復年限的延長,棲熱菌屬和奇球菌屬相對豐度隨恢復年限延長逐漸降低,CL500-29marinegroup、鏈霉菌屬相對豐度則逐漸增加。土壤pH和速效鉀是影響研究區沙棘人工林土壤細菌群落結構的主要影響因子。

(4)研究區沙棘林和草地土壤細菌主要包含5個一級功能和35個子功能,細菌生態功能豐富。最主要的細菌代謝功能在沙棘林土壤中較草地更為活躍,說明沙棘林土壤較草地細菌代謝潛力更強,而細菌代謝功能反過來也會通過分泌各種代謝產物來促進植物更好的生長和發育。