不同濃度L-谷氨酸鈉高效促進鹽單胞菌XH26胞內合成Ectoine及相關代謝途徑與Ectoine合成通路的關聯性※

沈國平,張 鑫,王智博,舒志萬,崔金子,衡 珊,汪明香,朱德銳,王 嶸

(青海大學醫學院基礎醫學研究中心,西寧 810016)

四氫嘧啶(Ectoine)作為嗜鹽微生物胞內重要的次級代謝產物,已廣泛應用于生物醫學和生物制劑等領域。如何改善和提高細菌的Ectoine生產能力是目前需要著重解決的問題[1]。目前,國內外實現Ectoine過量化生產的主要策略集中于:(1)篩選易于培養、能耐受高鹽且生長鹽度范圍寬泛、胞內Ectoine合成量大的菌株;(2)深入研究酸堿度、鹽度、溫度和碳氮源、合成前體物質等因素對Ectoine發酵產量的影響,并優化發酵工藝以提高產率;(3)基于Ectoine合成代謝通路和系統代謝工程原理,借助基因重組或基因敲除技術,構建高效工程菌株[2-4]。本研究通過構建小柴旦鹽湖野生菌株XH26的系統發育樹,明確進化分類地位并進行基因組測序。同時,探索合成前體底物(L-谷氨酸鈉)對菌株XH26胞內Ectoine的合成影響,利用基因組測序法分析L-谷氨酸鈉代謝途徑與Ectoine生物合成通路的關聯性,明確相關代謝基因的參與情況,為后續Ectoine的高效生產和系統代謝工程菌株改造提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與培養條件

從小柴旦鹽湖分離出的野生鹽單胞菌株H.campaniensisstrain XH26(CCTCC2019776 M)可高效合成Ectoine。菌株XH26的最佳培養基條件[5]:L-谷氨酸鈉35 mM、酶水解酪素100 mM、NaCl 1.0 M、MgSO4·7H2O 0.1 M和KCl 0.75 M,接種量為1%,培養時間為36 h,酸堿度為8,溫度為35℃。

1.2 主要試劑與設備

L-谷氨酸鈉和酶水解酪素(分析純,天津永大公司),乙腈(HPLC級,美國賽默飛公司),Invitrogen Trizol試劑(美國賽默飛公司),Ectoine標準對照品(HPLC級>95%,德國Fluka分析公司) ,微孔過濾器(0.22 μm水系膜,天津亳津公司),色譜分析柱(德國Merck公司);細菌Ribo-Zeror RNA去除試劑盒(美國Illumina公司),細菌基因組DNA試劑盒(QI Aamp Fast DNA Stool Mini Kit,德國Qiagen公司),qPCR試劑盒(TB Green?Premix Ex TaqTMII,日本Takara公司);高效液相色譜儀(HPLC-2100型,美國Agilent公司),NanoDrop 2000微量檢測儀(美國Thermo公司),PacBio Sequel測序平臺(美國PacBio公司),實時熒光定量PCR儀(Roche Light Cycler?96,瑞士Roche公司)。

1.3 16S rRNA基因測序與系統發育分析法

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行基因組DNA提取。用PCR法擴增16S rRNA基因時采用通用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT)[6]。PCR反應體系(25 μL):10×Buffer 2.5 μL,2.5 mM dNTPs 1 μL,正/反向引物(10 μM)各0.5 μL,DNA聚合酶0.2 μL,DNA模板(20～50 ng/μL)0.5 μL,最后用ddH2O補充至25 μL。PCR反應條件:94℃(240 s),94℃(45 s),55℃(45 s),72℃(60 s),25個循環,最后于72℃延伸10 min后純化回收目的條帶測序。通過NCBI數據庫獲取與菌株相似性較高的近緣物種基因序列,利用MEGA 7.0軟件進行相似性比對,采用鄰接法(Neighbor joining)構建系統發育進化樹(Bootstrap 1000),分析菌株XH26的系統發育地位[7]。

1.4 細菌全基因組測序法

細菌基因組DNA采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法分析完整性。采用微量檢測儀檢測DNA質量純度。細菌全基因組由武漢菲沙公司利用PacBio Sequel平臺完成測序。使用HGAP4、Canu(v.1.6)軟件對純三代數據進行組裝,并對組裝結果進行補洞、優化和評價[8]。使用Pbalign(v.0.3.1,默認Blasr算法)軟件將三代Subreads比對組裝到基因組上,用K-mer統計法評估基因組大小以及Scaffolds、Orphan contigs數目[9]。通過統計組裝序列的GC含量、重復序列度和覆蓋深度,分析Reads的測序深度。采用Genemark S軟件預測編碼基因,利用GO、COG和KEGG數據庫判斷直系同源基因,并進行功能基因注釋[10-11]。

1.5 Ectoine定量檢測法

根據文獻報道方法定量檢測Ectoine[5]。

1.6 熒光qRT-PCR法驗證L-谷氨酸鈉相關代謝基因

L-谷氨酸鈉濃度梯度設置為15、30、45 mM,同步培養XH26菌株36 h后,離心收集菌泥。采用Invitrogen Trizol試劑盒提取菌株XH26的總RNA,總RNA符合樣品要求(OD260/OD280=1.8～2.2;濃度>4 nM)。采用逆轉錄試劑盒進行qRT-PCR(2 μg RNA)實驗,將實驗產物cDNA 稀釋20倍作為qRT-PCR模板。用qPCR試劑盒進行定量檢測,將樣品混合均勻于96孔板,上機運行,反應體系(20 μL):cDNA 6 μL,TB溶液10 μL,正/反向引物各0.5 μL,無菌水3 μL。qRT-PCR運行條件:95℃(180 s),95℃(10 s),65℃(20 s),72℃(30 s),40個循環,在延伸階段采集每個循環的數據。內參基因為磷酸苷油酸脫氫酶(GADPH)基因,采用2-ΔΔCT法計算各基因的相對表達水平(n=3)[12]。PCR引物由南京金斯瑞公司合成(表1)。

表1 qRT-PCR實驗涉及L-谷氨酸鈉和Ectoine相關代謝的基因引物

2 結果

2.1 菌株XH26形態特征與系統發育

野生菌株XH26的菌落適應高鹽生長(0～3.0 M NaCl),最適生長鹽度為(NaCl)1.5 M。將16S rRNA基因測序(1438 bp)結果與NCBI數據庫結果比對,其結果顯示:菌株XH26與H.campaniensisLS21(No.CP007757.1)的序列相似性為99.86%(進化同源)。同時,系統發育分析(圖1)顯示:菌株XH26與鹽單胞菌屬類聚,隸屬于γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)海洋螺菌目(Oceanospirillales)鹽單胞菌科(Halomonadaceae)鹽單胞菌屬(Halomonas)的坎帕尼亞鹽單胞菌(H.campaniensis)。

紅色圓點代表本研究中應用的模式菌株及其NCBI登錄號

2.2 L-谷氨酸鈉對菌株XH26胞內Ectoine的合成影響

前期研究顯示,將L-谷氨酸鈉作為碳源時,Ectoine的合成量最大。分析不同濃度的L-谷氨酸鈉對菌株XH26胞內Ectoine合成量的影響(圖2)表明:隨著L-谷氨酸鈉濃度的增加,Ectoine的合成量隨之升高,當L-谷氨酸鈉濃度為30 mM時,Ectoine的合成量達到最大值(321.83 mg/L);此后,隨著L-谷氨酸鈉濃度的增加,Ectoine的合成量逐漸呈下降趨勢。由此表明XH26菌株合成Ectoine的最適L-谷氨酸鈉濃度為30 mM。

圖2 不同濃度的L-谷氨酸鈉影響菌株XH26的Ectoine合成量

2.3 菌株XH26全基因組特征分析

利用高通量測序法進行坎帕尼亞鹽單胞XH26基因組組裝(圖3)。結果顯示:模式菌株XH26的基因組大小為4 112 053 bp、預測編碼基因3 927個、編碼基因總長度為3 687 732 bp、編碼基因GC含量為53.28%、編碼基因總長/基因組大小為89.68%;tRNA為63個,5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA均為6個?；贜R數據庫注釋出的基因數目為3 669個(比例為93.43%)、SwissProt數據庫注釋出的基因數目為2 812個(71.61%)、COG數據庫注釋出的基因數目為3 252個(82.81%)、KEGG數據庫注釋出的基因數目為2 305個(58.70%)、GO數據庫注釋出的基因數目為2 618個(66.67%)。注釋基因數目共計3 669個(93.43%)。基于KEGG數據庫分析顯示,代謝富集基因主要涉及氨基酸代謝(amino acid metabolism)的相關基因277個、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)的相關基因221個、輔助因子和維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins)的相關基因182個、跨膜轉運(membrane transport)的相關基因178個、能量代謝(energy metabolism)的相關基因140個以及參與信號轉導(signal transduction)的相關基因115個。

圖3 坎帕尼亞鹽單胞菌株XH26的基因組組裝圖

2.4 L-谷氨酸鈉與Ectoine代謝通路的關聯分析

基于菌株XH26基因組進行KEGG氨基酸代謝通路和Ectoine合成途徑分析(圖4),結果顯示:Ectoine的生物合成采用保守的連鎖基因簇ectABC操縱子實現轉錄調控,合成前體底物是天冬氨酸半醛(L-aspartate-β-semialdehyde),由天冬氨酸(L-aspartate)經天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脫氫酶催化而來,分別由lysC、asd編碼;而天冬氨酸的代謝與三羧酸循環的代謝中間物(如草酰乙酸、蘋果酸、延胡索酸和琥珀酸)、琥珀酸半縮醛以及上游的谷氨酸(或谷氨酰胺)的分解代謝直接關聯。至此,在優化培養基中添加L-谷氨酸鈉(30 mM),能有效提高胞內Ectoine的合成量。通過增加L-谷氨酸鈉的碳/氮代謝流量(C/N metabolic flux)提高下游產物天冬氨酸或天冬氨酸半醛的濃度,最終導致胞內Ectoine合成量增加。該過程中可能涉及相關基因參與其中,如gltB、gltD、davT、gdhA、lysC與asd。

圖中紅色標記為物質變化過程中的主要官能基團

2.5 L-谷氨酸鈉代謝的參與基因驗證

設置L-谷氨酸鈉濃度梯度組(15、30、45 mM),培養菌株XH26并提取總RNA,并利用qRT-PCR分析Ectoine合成通路基因的相對表達量(圖5)。分析表明:隨著L-谷氨酸鈉濃度升高,基因gltB、gdhA、lysC的相對表達量呈遞增趨勢且有顯著差異(P<0.05),ectB、ectA和ectC的相對表達量亦呈遞增趨勢但無顯著差異;當L-谷氨酸鈉濃度較低時(15 mM),gltD、asd的相對表達量無顯著差異,當L-谷氨酸鈉濃度較高時(45 mM),gltD、asd的相對表達量較高(P<0.05)。此外,當L-谷氨酸鈉濃度為30 mM時,davT的相對表達量較高,而L-谷氨酸鈉為低濃度(15 mM)或高濃度(45 mM)時,相對表達量較低。

*:組間比較,P<0.05

3 討論

目前,規?；aEctoine選用的模式菌株主要集中在γ-變形菌綱海洋螺菌目鹽單胞菌科(Halomonadaceae),以鹽單胞菌屬(Halomonas)和色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)應用最為廣泛[3]。截至2023年3月,LPSN數據庫(http://www.bacterio.net/halomonas.html)收錄鹽單胞菌屬167個,成為種數最多的嗜鹽菌屬群,其典型代表有延長鹽單胞菌(H.elongate)、鹽水鹽單胞菌(H.salina)、南極堿鹽單胞菌(H.alkaliantarctica)、樊氏鹽單胞菌(H.ventosae)以及玻利維亞鹽單胞菌(H.boliviensis)等[16]。Romano等[13]從意大利坎帕尼亞Malvizza礦池中首次分離并命名為H.campaniensisstrain 5AG。該菌能在10.0℃～43.0℃范圍內生長,最適溫度為37.0℃;同時,該菌(在10% NaCl下生長最佳,生長pH范圍為7.0～10.0,最適pH值為9.0)大量合成細胞滲透壓保護劑Ectoine和谷氨酸。本研究選用的菌株XH26的生長鹽度范圍寬泛(0～3.0 M NaCl),最適生長鹽度(NaCl)為1.5 M;系統發育分析結果表明:該菌與H.campaniensis進化同源,具備高效的Ectoine合成能力。

L-谷氨酸鈉作為培養基碳源或氮源,可有效提高菌株胞內Ectoine的合成量[14]。姜蔚宇等的研究結果[15]顯示:當酵母提取物為4.0 g/L時,Ectoine的產量為123.84 mg/L;當L-谷氨酸鈉為0.355 M時,Ectoine的產量為134.37 mg/L;氮源酶水解酪素為12.5 g/L時,Ectoine的合成量為467.94 mg/L。Lang[14]和Chen[16]等在不同濃度的L-谷氨酸鈉(0.237、0.355、0.473、0.592 M)中培養鹽水鹽單胞菌H.salinaDSM 5928T,研究批式發酵過程中Ectoine的產量變化。當L-谷氨酸鈉濃度為0.473 M、NaCl濃度為0.5 M及pH為7.0時,Ectoine產量為8.21 g/L。本研究采用單批次方式搖瓶培養XH26菌株,當L-谷氨酸鈉濃度為0.03 M時,Ectoine的合成量最大值為321.83 mg/L。對比分析發現,以L-谷氨酸鈉作為碳/氮源,菌株XH26的Ectoine合成量較高。

本研究中,菌株H.campaniensisstrain XH26的基因組大小為4.11 Mb,預測編碼基因為3 927個,代謝通路富集基因主要涉及氨基酸代謝基因(277個基因)和碳水化合物代謝基因(221個基因)等。谷氨酸或谷氨酰胺的分解代謝通路,依次生成琥珀酸半縮醛→琥珀酸→延胡索酸→蘋果酸→草酰乙酸→天冬氨酸→天冬氨酸半縮醛等中間產物,最終合成Ectoine[12]。熒光qRT-PCR實驗證實:當L-谷氨酸鈉濃度從15 mM升至30 mM時,L-谷氨酸鈉的代謝流量增加了Ectoine的合成量。在該代謝過程中,主要參與基因的相對表達量呈明顯的上調趨勢,如基因davT(1 275 bp)、gdhA(2 427 bp)和lysC(1 398 bp)。基因davT、gdhA和lysC分別編碼4-氨基丁酸轉氨酶(424 aa)、谷氨酸脫氫酶(808 aa)和天冬氨酸激酶(465 aa)。谷氨酸脫氫酶和γ-氨基丁酸轉氨酶共同參與L-谷氨酸α-碳原子位點的脫羧基和脫氨基作用,生成琥珀酸半縮醛;天冬氨酸激酶參與L-天冬氨酰磷酸水解和脫氫反應,生成天冬氨酸半醛[3,17]。天冬氨酸激酶(EC2.7.2.4)是合成L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸和L-異亮氨酸等氨基酸的關鍵酶,亦是合成天冬氨酸族氨基酸的限速酶[18]。同時,隨著L-谷氨酸鈉濃度從15 mM升至45 mM,Ectoine合成核心基因簇ectABC的相對表達量均輕度上調,可促進Ectoine的合成效率。此外,當L-谷氨酸鈉濃度為45 mM時,基因gltD、lysC、asd的相對表達量均顯著上調,此時Ectoine的合成量并未顯著增加;與合成量最大值(L-谷氨酸鈉濃度為30 mM時)相比,反而有所下降,可能與前體物質(天冬氨酸半醛)的代謝流量分配有關,具體的調控機理有待深入研究。