多發性骨髓瘤細胞通過PI3K/AKT 信號通路促進M2 巨噬細胞極化的機制研究

彭逸倫，李楊，王曉桃，3*

1.541001 廣西壯族自治區桂林市，桂林醫學院臨床醫學院

2.541001 廣西壯族自治區桂林市，桂林醫學院附屬醫院臨床試驗中心

3.541001 廣西壯族自治區桂林市，桂林醫學院附屬醫院血液內科

多發性骨髓瘤是終末分化的B 淋巴細胞惡性腫瘤，是第二常見的血液系統惡性腫瘤［1］。由于瘤細胞本身的異質性、克隆的演變等導致復發而進展、治療失敗，其根源在于骨髓微環境機制尚未明確［2］。因此迫切需要探索多發性骨髓瘤發病相關因素及機制，從而采取有效的預防策略，降低多發性骨髓瘤發病率。

腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）介導腫瘤相關巨噬細胞最近已成為研究者們關注的焦點，TME 對瘤細胞的發生、發展、轉移、耐藥和復發均有重要的作用［3］。巨噬細胞是炎性細胞之一，是參與固有免疫的重要細胞，其表型和功能與多發性骨髓瘤微環境相關，根據不同的骨髓微環境（bone marrow microenvironment，BMME）信號而表現出極高的可塑性和多功能性，一般認為有兩種：M1 型，即經典活化的巨噬細胞，具有白介素（interleukin，IL）-12 高/IL-10低的表型，可產生IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，具有明顯促炎和抗腫瘤活性；M2 型，即替代活化的巨噬細胞，在腫瘤患者中稱腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associatedmacrophages，TAMs），具有IL-12 低/IL-10 高的表型，表達CD163、CD204 和CD206，產生IL-10、IL-13 等抗炎因子，具有抑制腫瘤免疫、促進腫瘤發展的作用［4］。TME 中，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2 和MMP9 作為腫瘤的生物標志物具有重要功能，可作為腫瘤預測指標、復發指標及預后判斷等，并對血液腫瘤的生長、侵襲和轉移具有重要意義［5］。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）通路的異常激活在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學行為中起著關鍵作用［6］。急性白血病、慢性白血病、各種類型的淋巴瘤和多發性骨髓瘤中經常發現PI3K/AKT 通路激活及其下游效應。PI3K/AKT 通路激活甚至發生在腫瘤早期階段，并與多種人類癌癥不良預后和治療耐藥相關［7］。當磷酸酶基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）缺失時，PI3K/AKT 通路可能會被激活，這種激活可能會導致癌癥的發生和發展。在多發性骨髓瘤患者中，推測骨髓瘤細胞通過激活PI3K/AKT 信號通路促進巨噬細胞在BMME 里向M2 極性轉變，從而刺激瘤細胞增殖，導致骨髓瘤的發生、發展，復發難治。

本研究選取多發性骨髓瘤患者為研究對象，探討M2 巨噬細胞在多發性骨髓瘤患者中的表達及PI3K/AKT信號通路促進M2 巨噬細胞極化的機制，為臨床多發性骨髓瘤疾病的靶向治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2021 年10 月—2022 年4 月于桂林醫學院附屬醫院血液內科確診的多發性骨髓瘤患者48 例為試驗組，選取同期健康志愿者（血液內科骨髓移植健康供者）30 名為對照組。本研究已通過桂林醫學院附屬醫院倫理委員會倫理審查（編號：2021YJSLL-86），研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.1.1 患者納入標準：（1）根據國際骨髓瘤工作組更新的多發性骨髓瘤診斷標準診斷為多發性骨髓瘤［8-9］；（2）年齡≥18 歲。

1.1.2 患者排除標準：繼發性（之前診斷為其他惡性腫瘤的患者）或混合性（同時診斷為多發性骨髓瘤和其他惡性腫瘤的患者）多發性骨髓瘤；（2）合并風濕系統的自身免疫性疾病或其他腫瘤性疾病；（3）合并其他造血系統疾病、淋巴組織疾病或實體腫瘤病史；（4）孕婦或哺乳期婦女。

1.2 資料收集

收集多發性骨髓瘤患者及健康志愿者的相關臨床特征資料，包括年齡、性別、免疫球蛋白分型、Durie-Salmon 分期、ISS 分期、骨質損害程度等。

1.3 實驗方法及分組

1.3.1 標本處理、細胞培養與轉染：采集研究對象空腹外周靜脈血，提取單個核細胞，-80 ℃凍存。人多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226 和THP-1（均由桂林醫學院附屬醫院臨床試驗中心提供）進行傳代培養。采用佛波酯分化培養THP-1 細胞為巨噬細胞。RPMI8226 細胞培養并用siRNA 干擾沉默PTEN 處理分成3 組：空白組、siRNA-PTEN 實驗組和siRNA 對照組。

1.3.2 蛋白免疫印跡法（Western blot）：RPMI8226 細胞系采用AKT（艾菲公司）、p-AKT（艾菲公司）、PI3K-p85（艾菲公司）、p-PI3K-p85（艾菲公司）的一抗進行免疫印跡檢測。以β-actin（艾菲公司）作為內對照，采用Western blot 檢測空白組、siRNA-PTEN 實驗組、siRNA 對照組3 組的AKT、p-AKT、PI3K-p85、p-PI3K-p85 蛋白表達水平。

1.3.3 熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）：為了證明PI3K/AKT 信號通道的激活可以提高多發性骨髓瘤細胞的生長和侵染水平，將空白組、siRNA-PTEN 實驗組和siRNA 對照組的瘤細胞進行熒光定量PCR 實驗。設計引物（表1），提取RPMI8226 細胞THP-1 誘導分化巨噬細胞的RNA，進行逆轉錄，擴增反應條件為：首先93 ℃預變性，93 ℃7 min，55 ℃1 min，72 ℃ 1 min，共經過40 次循環，72 ℃ 7 min。檢測瘤細胞MMP2、MMP9 的mRNA，檢測共培養體系中THP-1 誘導分化巨噬細胞的M2 型巨噬細胞的標志物精氨酸酶1（arginase 1，ARG-1）和IL-10 的mRNA。

表1 實時定量PCR 使用引物列表Table 1 List of primers used for real-time quantitative PCR

1.3.4 流式細胞術：收集空白組、siRNA-PTEN 實驗組、siRNA 對照組3 組細胞培養基上清液加入巨噬細胞共培養體系后分為4 組：M0 巨噬細胞組、瘤細胞上清液組、siRNA-PTEN 上清液組、siRNA 上清液組。采用流式細胞術，檢測多發性骨髓瘤上清液共培養的M2 巨噬細胞和提取的單個核細胞中特異性抗體CD163、CD206、F4/80 表達水平。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t 檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗；計數資料以相對數表示。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象基本臨床資料

試驗組48 例多發性骨髓瘤患者年齡為65.5（56.8，75.0）歲，其中男25 例（52.1%）、女23 例（47.9%）；免疫球蛋白（Ig）分型：IgA 14 例（29.2%），IgG 25例（52.1%），IgD 3 例（6.3%），其他6 例（12.4%）；Durie-Salmon分期：Ⅰ期5例（10.4%），Ⅱ期7例（14.6%），Ⅲ期36 例（75.0%）；ISS 分期：Ⅰ期9 例（18.8%），Ⅱ期13 例（27.1%），Ⅲ期26 例（54.1%）；骨損害36 例（75.0%）；合并骨質破壞25 例（52.1%）。對照組30 例健康志愿者年齡為58.0（52.0，70.0）歲，其中男12 例（40.0%）、女18 例（60.0%）；異常單克隆免疫球蛋白（M 蛋白）1 例（3.3%）。

2.2 研究對象外周血M2 巨噬細胞表達水平

經過流式細胞術檢測，試驗組中CD163、CD206 標記的M2 巨噬細胞表達水平為（1.763±0.316），對照組中CD163、CD206 標記的M2 巨噬細胞的表達水平為（0.675±0.244），試驗組M2 巨噬細胞表達水平高于對照組，差異有統計學意義（t=0.855，P＜0.001），見圖1。

圖1 研究對象外周血M2 巨噬細胞表達水平Figure 1 Expression levels of M2 macrophages in peripheral blood

2.3 siRNA 轉染多發性骨髓瘤細胞后PTEN mRNA 表達水平

采用siRNA 轉染RPMI8226 細胞（圖2），并用熒光定量PCR 檢測轉染效果。經熒光定量PCR 分析，多發性骨髓瘤細胞培養的空白組PTEN mRNA 表達水平為（1.035±0.039），siRNA-PTEN 實驗組PTEN mRNA 表達水平為（0.240±0.059），siRNA 對照組PTEN mRNA表達水平為（1.091±0.083），3 組PTEN mRNA 表達水平比較，差異有統計學意義（F=171.861，P＜0.001）；其中siRNA-PTEN 實驗組PTEN mRNA 表達水平低于空白組和siRNA 對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 倒置顯微鏡下RPMI8226 細胞經siRNA 轉染后的細胞（熒光染色，×40）Figure 2 The cellular level of RPMI8226 cells transfected with siRNA under inverted microscope

2.4 多發性骨髓瘤細胞PI3K/AKT 蛋白表達水平

為了驗證多發性骨髓瘤中PI3K/AKT 通路的激活情況，采用Western blot 實驗檢測多發性骨髓瘤細胞培養的空白組、siRNA-PTEN 實驗組、siRNA 對照組的AKT、p-AKT、PI3K-p85、p-PI3K-p85 蛋白表達水平，見圖3。

圖3 多發性骨髓瘤細胞PI3K/AKT 蛋白表達圖Figure 3 Protein expression map of PI3K/AKTin multiple myeloma cells

3 組多發性骨髓瘤細胞p-AKT/AKT、p-PI3K-p85/PI3K-p85 蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（P=0.008）； 其中siRNA-PTEN 實驗組中p-AKT/AKT、p-PI3K-p85/PI3K-p85 蛋白表達水平高于空白組和siRNA 對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 多發性骨髓瘤細胞中PI3K/AKT 蛋白表達水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of protein expression level of PI3K/AKT in multiple myeloma cells

表2 多發性骨髓瘤細胞中PI3K/AKT 蛋白表達水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of protein expression level of PI3K/AKT in multiple myeloma cells

注：AKT= 絲氨酸/ 蘇氨酸激酶，PI3K= 磷脂酰肌醇-3- 激酶；a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示與siRNA-PTEN 實驗組比較P＜0.05。

組別p-AKT/AKTp-PI3K-p85/PI3K-p85空白組1.070±0.0700.843±0.287 siRNA-PTEN 實驗組2.051±0.297a1.801±0.111a siRNA 對照組1.229±0.344b0.950±0.079b F 值11.79524.579 P 值0.008P＜0.001

2.5 多發性骨髓瘤細胞MMP2、MMP9 的mRNA 表達水平

3 組多發性骨髓瘤細胞MMP2、MMP9 的mRNA 表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.001）；其中siRNA-PTEN 實驗組中MMP2、MMP9 的mRNA 表達水平高于空白組和siRNA 對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 多發性骨髓瘤細胞MMP2、MMP9 的mRNA 表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of the mRNA expression levels of MMP2 and MMP9 in multiple myeloma cells

表3 多發性骨髓瘤細胞MMP2、MMP9 的mRNA 表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of the mRNA expression levels of MMP2 and MMP9 in multiple myeloma cells

注：a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示與siRNA-PTEN 實驗組比較P＜0.05。

組別MMP2 mRNAMMP9 mRNA空白組0.979±0.0411.087±0.101 siRNA-PTEN 實驗組2.089±0.155a2.670±0.439a siRNA 對照組1.149±0.157b1.176±0.163b F 值63.77731.007 P 值P＜0.001P＜0.001

2.6 THP-1 誘導分化巨噬細胞中M2 巨噬細胞特異性抗體CD163、CD206、F4/80 表達水平

4 組M2 巨噬細胞特異性抗體CD163+F4/80、CD163+F4/80 表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.001）；其中與M0 巨噬細胞組相比，瘤細胞上清液組、siRNA-PTEN 上清液組和siRNA 上清液組M2巨噬細胞特異性抗體CD163+F4/80、CD163+F4/80、CD163+F4/80 表達水平均升高；且siRNA-PTEN 上清液組M2 巨噬細胞特異性抗體表達水平高于瘤細胞上清液組和siRNA 上清液組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4、表4。

圖4 THP-1 誘導分化巨噬細胞中M2 巨噬細胞特異性抗體CD163、CD206、F4/80 表達水平Figure 4 The expression levels of M2 macrophage-specific antibodies CD163，CD206，and F4/80 induced by THP-1 in differentiated macrophages

表4 THP-1 誘導分化巨噬細胞中M2 巨噬細胞特異性抗體CD163、CD206、F4/80 表達水平比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of the expression levels of M2 macrophage-specific antibodies CD163，CD206，and F4/80 induced by THP-1 in differentiated macrophages

注：a 表示與M0 巨噬細胞組比較P＜0.05，b 表示與瘤細胞上清液組比較P＜0.05，c 表示與siRNA-PTEN 上清液組比較P＜0.05。

組別CD163+F4/80CD206+F4/80 M0 巨噬細胞組2.900±0.6565.567±1.332瘤細胞上清液組21.667±0.874a11.033±1.498a siRNA-PTEN 上清液組46.067±1.872ab40.200±1.493ab siRNA 上清液組22.300±2.252ac12.267±1.858ac F 值384.218299.663 P 值P＜0.001P＜0.001

2.7 THP-1 誘導分化巨噬細胞中M2 巨噬細胞特異標志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達水平

4 組M2 巨噬細胞特異標志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達水平比較，差異有統計學意義（F=19.826，P＜0.001）；其中與M0巨噬細胞組相比，瘤細胞上清液組、siRNA-PTEN 上清液組和siRNA 上清液組M2 巨噬細胞特異標志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達水平均升高；且siRNA-PTEN 上清液組M2 巨噬細胞特異標志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達水平高于瘤細胞上清液組和siRNA 上清液組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 THP-1 誘導分化巨噬細胞中M2 巨噬細胞特異標志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達水平比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of the expression levels of M2 macrophage-specific markers ARG-1 and IL-10 induced by THP-1 in differentiated macrophages

表5 THP-1 誘導分化巨噬細胞中M2 巨噬細胞特異標志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達水平比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of the expression levels of M2 macrophage-specific markers ARG-1 and IL-10 induced by THP-1 in differentiated macrophages

注：a 表示與M0 巨噬細胞組比較P＜0.05，b 表示與瘤細胞上清液組比較P＜0.05，c 表示與siRNA-PTEN 上清液組比較P＜0.05。

組別ARG-1 mRNAIL-10 mRNA M0 巨噬細胞組0.965±0.0941.015±0.099瘤細胞上清液組2.208±0.379a1.722±0.171a siRNA-PTEN 上清液組4.712±1.122ab3.653±0.601ab siRNA 上清液組2.173±0.298ac1.839±0.199ac F 值19.82634.507 P 值P＜0.001P＜0.001

3 討論

多發性骨髓瘤是一種終末分化的B 淋巴細胞惡性腫瘤。BMME 中，漿細胞的異常克隆增殖可能源于無癥狀前體疾病，如意義未明的單克隆丙種球蛋白病（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）或冒煙型骨髓瘤（smoldering multiple myeloma，SMM）［10］。這種疾病的主要癥狀包括高鈣血癥、骨疾病、腎功能不全和貧血等。疾病進展和隨后的復發以亞克隆進化和耐藥為特征，幾乎所有患者最終均會發展為復發和難治類型，其進展受到TME 影響顯著［11］。因此，研究多發性骨髓瘤微環境中免疫細胞在疾病發生、進展中的機制，并轉化為臨床治療作用具有重要意義。

本研究選取多發性骨髓瘤患者的外周血單個核細胞進行流式細胞術實驗，結果顯示，M2 巨噬細胞表達水平在多發性骨髓瘤患者中相比健康志愿者上調（P＜0.001），與許多國內外研究相一致［12-13］。在多種癌癥中，腫瘤細胞會分泌M2 樣細胞因子，如IL-10、趨化因子配體（CCL）2/3/4/5/7/8、基質細胞衍生因子1（SDF-1）、血管內皮生長因子（VEGF）和血小板細胞衍生生長因子（PDGF），這些因子可以吸引更多的單核細胞和M0 巨噬細胞，并將其轉化為M2 表型。大多數腫瘤內巨噬細胞表現出M2 表型，并與一些惡性腫瘤的不良預后相關［14］。在TME 中，TAMs 最常出現在M2 樣的腫瘤前表型中［14］。有研究表明，多發性骨髓瘤患者中TAMs 明顯增多，提示患者具有不良預后［15］。TAMs 的極化過程可能由骨髓瘤微環境內的瘤細胞調控，其表型比例隨多發性骨髓瘤進展而發生變化。研究發現在腫瘤發展的早期階段，皮膚中M1 TAMs 在黑色素瘤中轉移為M2 表型，M2 巨噬細胞的存在與不良預后相關［16-17］。有文獻發現在多發性骨髓瘤患者體內TAMs增強與多發性骨髓瘤進展有關［18］。本研究發現在多發性骨髓瘤患者體內存在M2 巨噬細胞高表達。因此，需要進一步探討多發性骨髓瘤細胞中導致M2 巨噬細胞極化并促進骨髓瘤進展的機制。

回顧既往關于腫瘤相關巨噬細胞和瘤細胞遷移、侵襲、增殖的相關研究，TAMs 對腫瘤細胞幾乎沒有細胞毒性，并促進了腫瘤細胞增殖［19-20］。在TME 中，TAMs 和腫瘤細胞通過分泌細胞因子促進腫瘤細胞增殖。體外研究證實，結腸癌細胞通過分泌轉化生長因子β1（TGF-β1）上調巨噬細胞中補體應答基因32（RGC-32）的表達，RGC-32 促進巨噬細胞的遷移，進一步加速結腸癌細胞的增殖［21］。通過體外共培養TAMs 和CT26結腸癌細胞，發現TAMs 調控的氧化應激可以影響結腸癌細胞的增殖，并且癌癥的侵襲和轉移是導致90%以上患者死亡的主要原因［22-23］。許多研究表明，TAMs的促腫瘤作用可以誘導結腸癌細胞的生長和轉移。通過MAPK 活化蛋白激酶2（MK2），TAMs 可以分泌單核細胞趨化蛋白MCP1 和巨噬細胞炎癥蛋白1α 和2α，這些蛋白質可以誘導體外惡性腫瘤細胞的生長和入侵，并且促使癌癥的發展和轉化［24］。通過調節煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的活性，TAMs 可以有效抑制活性氧（ROS）的產生，進而維持TME 的氧化還原平衡，進而有效促使腫瘤細胞生長［25］。

因此，本研究就多發性骨髓瘤中PI3K/AKT 通路活化能否導致瘤細胞增殖和侵襲能力增強進行了驗證。MMP2 和MMP9 作為腫瘤生物標志物有重要功能，可作為腫瘤預測指標，對血液腫瘤的生長、侵襲和轉移具有重要意義，MMP2 和MMP9 高表達提示腫瘤侵襲轉移能力增強，疾病進展。本研究采用熒光定量PCR 檢測腫瘤標志物MMP2、MMP9 的mRNA 表達水平，其在siRNA-PTEN 實驗組表達水平中較空白組和siRNA 對照組均上調（P＜0.001），表明PI3K/AKT 通路激活促進瘤細胞增殖和侵襲能力增強。

結合本課題組的前期研究結果和國內外研究，本研究發現多發性骨髓瘤中M2 巨噬細胞極化與PI3K/AKT 通路的活化相關［26-27］，并進行驗證。采用熒光定量PCR 檢測，siRNA-PTEN 上清液組通路激活后M2巨噬細胞特異性抗體CD163+F4/80 和CD206+F4/80 表達水平相對瘤細胞上清液組和siRNA 上清液組均上調（P＜0.05）；采用流式細胞術檢測M2 巨噬細胞特異標志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達水平，在siRNAPTEN 上清液組中表達水平較瘤細胞上清液組和siRNA上清液組均上調（P＜0.001）；表明多發性骨髓瘤細胞中PI3K/AKT 通路激活促進M2 巨噬細胞極化。

綜上所述，本研究進一步證實了多發性骨髓瘤患者體內M2 巨噬細胞增多，在多發性骨髓瘤細胞中可能是通過激活PI3K/AKT 通路促進M2 巨噬細胞極化。本研究實驗設計具有系統性創新特色，明確了PI3K/AKT 信號通路在MM 骨髓微環境中參與CD163、CD206 陽性的M2 型巨噬細胞極性改變的發生和發展，對臨床中對多發性骨髓瘤疾病的靶向治療有指導意義。

作者貢獻：王曉桃提出研究思路，設計研究方案，負責論文起草、最終版本的修訂，對論文負責；彭逸倫進行研究過程的實施，包括進行細胞實驗、流式細胞術實驗，熒光定量PCR 實驗，調查對象的選取、樣本的采集等；李楊負責數據收集、采集、清洗和統計學分析等。

本文無利益沖突。