跨膜蛋白79在肝細胞癌中的表達及臨床意義

朱文標，丘 波，謝壽城，肖煥欽，劉高敏

(1.汕頭大學醫學院梅州臨床學院/梅州市人民醫院病理科，廣東 梅州 514031；2.嘉應學院分子生物學中心實驗室/病理教研室，廣東 梅州514031；3.汕頭大學醫學院梅州臨床學院/梅州市人民醫院肝膽外科，廣東 梅州 514031)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前我國第4 大常見惡性腫瘤，并且在腫瘤致死病因中居第2 位，嚴重威脅我國人民的生命和健康。要實現《“健康中國2030”規劃綱要》中總體癌癥5 年生存率提高15%的目標，關鍵在于早期發現、早期診斷及提高根治率和長期生存率[1]。近年來，我國新發HCC病例中，中國肝癌臨床分期(China liver cancer staging，CNLC)Ia-IIa 期比例逐年提高，HCC患者預后明顯改善[2]?！对l性肝癌診療指南(2022 年版)》推薦Ia-IIa 期HCC 首選治療方式是根治性手術切除，但術后復發轉移率達40%～70%[3]，目前尚缺乏有效的術后復發轉移的預測因素。

跨膜蛋白(transmembrane protein，TMEM)是一類包含至少1 個跨膜片段的膜蛋白，研究表明其與惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉移密切相關[4]。TMEM的異常表達已被報道可作為腫瘤患者的新的預后生物標志物和治療靶標?？缒さ鞍?9(transmembrane protein 79，TMEM79)包含一個較長的N-端結構域，5次跨膜結構域和短C-端結構域，但其具體功能仍很不清晰。TMEM79 主要充當轉運蛋白和受體，在前列腺癌細胞中表達下調，可作為前列腺癌診斷的標記物[5]。我們前期對癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫分析發現TMEM79 mRNA 在乳腺癌、膽管癌、結直腸癌、宮頸鱗狀細胞癌、腎透明細胞癌、肺癌及HCC等中顯著高表達。本研究采用免疫組織化學方法檢測HCC癌組織及配對非腫瘤組織中TMEM79的表達，分析其與患者臨床病理學指標及預后的關系，評估其對Ia-IIa 期HCC 患者行根治性手術切除后復發轉移及生存情況的預測價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2011 年5 月—2017 年8 月在梅州市人民醫院行根治性手術切除的HCC病例。納入標準為術后病理診斷為HCC；術前未行消融治療和未經動脈化療栓塞治療等其他治療。收集病例的臨床病理指標，包括年齡、性別、HCC 的分化程度(Edmondson-Steiner 分級)、 組 織 學 分 型、 微 血 管 侵 犯(microvascular invasion，MVI)、CNLC 等。本研究獲得梅州市人民醫院倫理委員會批準(批準文號：梅市倫審2020-C-65)。

研究納入病例95 例，男性83 例(87.4%)，女性12例(12.6%)；年齡28～84歲，平均年齡56歲，中位年齡58 歲。按照CNCL 分期，Ia-IIa 期82 例，Ⅱb 期及Ⅲa期共13 例；按照癌組織分化程度分類，Edmondson-Steiner 分級1～2級53例，3～4級42例；無MVI的為41例，有MVI的為54例。

1.2 組織樣本及免疫組織化學檢測

HCC癌組織和配對非腫瘤組織蠟塊行免疫組織化學檢測，抗TMEM79 抗體購自英國艾博抗公司(Abcam)。免疫組織化學染色采用Envision 兩步法，步驟主要包括：①干燥切片二甲苯脫蠟，后檸檬酸高溫高壓修復抗原；②TMEM79 單克隆抗體(1∶200稀釋)37 ℃濕盒孵育30 min；③二抗孵育30 min；④3,3'-二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染后封片觀察。本實驗采用PBS 代替一抗為陰性對照，良性前列腺組織切片為陽性對照。

1.3 免疫組織化學結果判定

免疫組織化學結果以免疫組織化學染色分數的形式呈現，判讀由兩位病理醫師對切片進行獨立評分。根據細胞的染色強度及著色細胞百分數進行綜合評分。染色強度分為：細胞膜及細胞漿均無染色為0分、出現淡黃色顆粒為1 分；出現淺棕黃色顆粒為2分；出現大量深棕黃色的顆粒為3 分。著色細胞百分比評分為：[0，1%]為0 分；(1%，25%]為1 分；(25%，50%]為2 分；(50%，75%]為3 分；(75%，100%]為4分。兩位病理醫師評分的平均分為該病例免疫組織化學結果評分的最終分數，代表蛋白的表達水平。免疫組織化學染色分數為染色強度評分×著色細胞百分比評分。≥5 分定義為陽性表達，＜5 分定義為陰性表達。

1.4 隨 訪

對納入病例進行隨訪，方式包括門診隨訪、電子病歷和電話追蹤?？偵嫫?overall survival，OS)指從術后開始到任何原因導致死亡的時間。無進展生存期(progression-free survival，PFS)指從術后開始至隨訪過程中影像學首次發現復發轉移或任何原因導致的死亡(以先發生者為準)的時間。所有病例無失訪。本研究隨訪截止日期為2023-03-22，隨訪時間為66～142個月。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0 版進行統計分析。配對資料Wilcoxon 檢驗比較癌組織與配對非腫瘤組織TMEM79表達差異；卡方檢驗比較癌組織與配對非腫瘤組織的陽性表達率；卡方檢驗分析TMEM79表達與臨床病理指標的關系；對數秩檢驗(log-rank test)比較不同TMEM79 表達水平患者的生存差異；多因素Cox 回歸分析影響Ia-IIa 期HCC 術后復發轉移及生存的因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TMEM79蛋白表達的免疫組化檢測結果

TMEM79 蛋白在癌組織及非腫瘤組織中的表達見圖1，TMEM79 蛋白表達定位于細胞膜與細胞漿，TMEM79 蛋白在癌組織中的表達水平高于配對非腫瘤組織(Z=-5.347，P＜0.01)。TMEM79蛋白在癌組織中的陽性表達率為49.5%(47/95)，在非腫瘤組織中的陽性表達率為20.1%(20/95)。TMEM79蛋白在癌組織中的陽性表達率高于非腫瘤組織(χ2=4.270，P＜0.05)。

圖1 TMEM79蛋白在HCC及非腫瘤組織的表達情況

2.2 TMEM79蛋白表達及與患者臨床病理指標的關系

TMEM79 蛋白表達及與患者臨床病理指標的關系見表1，TMEM79 蛋白表達與年齡、性別、組織學分型、MVI、CNCL 等無明顯相關，不同分化程度的HCC 組織間的陽性表達率差異具有統計學意義(P=0.003)。

表1 TMEM79蛋白表達與HCC臨床病理指標的關系

2.3 TMEM79蛋白表達與HCC患者預后的關系

TMEM79 蛋白表達與HCC 患者預后的關系見圖2。納入病例PFS 為54.8[95%CI(45.0，64.6)]個月。TMEM79 蛋白陽性表達組PFS 為40.8[95%CI(29.1，52.5)]個月，5 年無進展生存率為(23.4±6.2)%；TMEM79 蛋白陰性表達組PFS 為72.5[95%CI(58.6，86.3)]個月，5 年無進展生存率為(52.1±7.2)%。TMEM79 蛋白陽性表達組PFS 顯著短于TMEM79 蛋白陰性表達組(P＜0.01)。納入病例5 年生存率為(62.1±5.0)%，TMEM79 蛋白陽性表達組5 年生存率為(36.2±7.0)%，TMEM79 蛋白陰性表達組5 年生存率為(83.3±5.4)%，TMEM79 蛋白陽性表達組OS 顯著短于TMEM79蛋白陰性表達組(P＜0.01)，TMEM79蛋白陽性表達組術后OS顯著短于TMEM79蛋白陰性表達組。

圖2 TMEM79蛋白表達與HCC患者預后

2.4 Ia-IIa期HCC患者預后的Cox回歸分析

CNLC Ia-IIa 期HCC 患者預后影響的多因素分析結果見表2。CNLC Ia-IIa 期HCC 病例共82 例，調整患者性別和年齡后，將腫瘤直徑、腫瘤分化程度、組織學類型、MVI 及TMEM79 蛋白表達進行Cox 模型回歸分析，發現TMEM79 蛋白陽性表達是Ia-IIa 期HCC患者術后復發或轉移的危險因素[HR=2.001，95%CI(1.152，3.476)，P＜0.05]。HCC 團 片 型 組 織 學 形 態[HR=3.090，95%CI(1.317，7.273)，P＜0.05]及TMEM79蛋白陽性表達[HR=3.323，95%CI(1.652，6.683)，P＜0.05]是影響Ia-IIa期HCC患者術后生存的危險因素。

表2 Ia-IIa期HCC患者的預后影響的多因素分析

3 討 論

本研究發現TMEM79蛋白表達與HCC分化程度相關，在癌組織中的表達水平高于配對非腫瘤組織，TMEM79 蛋白陽性表達與HCC 不良預后相關，在Ia-IIa 期患者，TMEM79 蛋白陽性表達是HCC 復發轉移及生存的危險因素。

越來越多的證據表明TMEM 異常表達在腫瘤的發生和進展中發揮著重要作用[4-6]。TMEM48 在宮頸癌癌組織和細胞系中過表達，通過激活Wnt/β-catenin通路促進宮頸癌細胞增殖和侵襲[7]，TMEM44在腎細胞癌中表達顯著上調，是腎透明細胞癌的獨立預后因素[8]。TMEM 起抑制腫瘤進展的作用，TMEM100 通過抑制FAK/PI3K/AKT 信號傳導，在抑制前列腺癌增殖、遷移和侵襲方面發揮著至關重要的作用[9]；肺癌組織中TMEM196 通過調節Wnt/β-catenin 信號通路抑制肺癌轉移，TMEM229A通過沉默ERK通路來抑制非小細胞肺癌進展[10-11]等。在HCC 中，TMEM106C 在癌組織中過表達，與HCC 的惡性特征和不良預后有關[12]，TMEM206表達上調與HCC不良預后相關[13]，TMEM201過表達顯著促進HCC進展，可能在細胞周期相關和免疫相關途徑中發揮關鍵作用[14]；而TMEM205通過降低免疫抑制細胞的水平并促進細胞毒性T 細胞的浸潤發揮腫瘤抑制作用。TMEM79 被發現在前列腺癌中表達顯著下調，可作為前列腺癌的診斷指標[5]，但TMEM79在HCC中的表達及功能尚不清楚。

TMEM79 與免疫反應關系密切引起了研究者的興趣。TMEM79 對氧化應激具有保護作用，在特應性皮炎中TMEM79 缺失會導致皮膚炎癥和瘙癢[15]。TMEM79 與腫瘤的關系在前列腺癌中有了較為詳細的探討，有研究發現TMEM79表達下調是前列腺癌患者的預后預測因素，且可能與免疫失調有關[5，16]。本研究結果提示TMEM79蛋白在正常生理功能中發揮重要作用；TMEM79蛋白在HCC中表達高于配對非腫瘤組織，其表達水平與HCC 的分化程度有關，我們推測TMEM79蛋白在HCC進程中可能起著重要作用；但是TMEM79表達上調是作為HCC進展中的伴隨事件還是作為HCC進展的促進因素，尚需進一步闡明。

肝臟儲備功能良好的CNLC Ia-IIa 期HCC 首選治療方式是手術切除[1]，術后復發轉移是影響手術切除后生存的主要原因，目前缺乏有效的預測生物標記物。本研究發現TMEM79 陽性表達與不良預后相關，可作為Ia-IIa 期HCC 患者術后的危險因素之一，對Ia-IIa期HCC術后復發轉移及生存有一定預測價值。

綜上所述，TMEM79 在HCC 中表達上調，TMEM79 蛋白表達與HCC 分化程度相關；TMEM79 陽性表達與患者不良預后關聯，可作為Ia-IIa 期HCC 患者術后復發轉移及生存的危險因素。本研究是關于TMEM79蛋白在HCC中表達的首次報告，但樣本量較少，仍需較大樣本多中心研究。另外，在細胞水平、動物模型上的研究對于闡明TMEM79異常表達對HCC的影響及機制非常有必要。