涼山冕寧煙田節肢動物種類調查

侯園園,王 飛,江連強,徐蓬軍,任廣偉 ,王李芳*,王秀芳

(1.中國農業科學院煙草研究所,山東 青島 266101; 2.四川省煙草公司瀘州市公司,四川 瀘州 646000;3.四川省煙草公司涼山州公司,四川 西昌 615000)

涼山州位于四川省西南部,屬于亞熱帶季風氣候區,地貌復雜,土壤肥力中等,是我國重要的煙草種植區,涼山煙區占全省煙草的60%以上,冕寧縣是涼山重要的煙葉產區之一[1-3]。有研究通過空間掃描算法檢測到四川涼山煙區為煙草病蟲害高發區[4],而通過節肢動物調查,弄清農田的生物群落結構,使害蟲的預測預報更加準確,有助于實施煙草病蟲害的綠色防控[5]。劉旭等[6]對四川省大田生長期煙草害蟲種類進行調查發現,煙田有昆蟲綱7目、25科、70種及軟體動物門腹足綱1目、3科、5種。目前對四川冕寧煙區節肢動物的調查主要針對半翅目害蟲煙蚜(Myzuspersicae),對節肢動物種群動態的報道較少[7-8]。

隨著分子生物學研究的深入,應用分子生物學技術鑒定昆蟲物種,擺脫了蟲態的限制,能夠在分子生物學水平上獲得精確的物種信息,該技術對傳統昆蟲形態學的鑒定起到了合理的補充。其中,DNA條形碼技術(DNA barcoding)被認為是最簡單、迅速、精確的方法,目前該技術在實蠅鑒定、姬小蜂科物種鑒定、蚜蟲快速鑒定、鱗翅目害蟲鑒定等方面也多有報道[9-13]。DNA條形碼在世界范圍內已經廣泛用于生物物種鑒定,并逐漸成為一種有效的通用分類手段[14-16]。

研究主要通過目測法和掃網法[17]對四川涼山冕寧煙區的節肢動物種群進行普查,并利用DNA條形碼技術對采集到的樣品進行鑒定,為四川冕寧煙田害蟲的預測預報、為煙田天敵的保護利用和煙田綜合管理系統的建立提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 調查地煙田基本情況

試驗在四川省涼山市冕寧煙區進行,試驗田位于28°33′14″N,102°10′26″E,海拔1804m,屬于亞熱帶季風氣候區,雨熱同期,土壤肥力中等,主栽品種為“云煙87”。

1.2 調查方法

調查時間于2020年7月,共設4個調查取樣點,取樣點隨機區組排列,且每個小區面積不小于667m2,每個小區按5點法定點調查,每點10株。

1.2.1 目測法 每個小區共調查50株煙株,采取整體目測法,調查時先觀察煙株葉片上的節肢動物,再全株調查,包括逐個剝開煙草的花、翻開葉片查看莖稈,同時對點內雜草上的節肢動物的種類和數量進行統計。

1.2.2 掃網法 捕蟲網規格為網口直徑30cm,網深35cm,桿長60cm。對煙株和煙株周圍的雜草進行掃網,每次調查掃網50次(揮網一個來回為掃網1次),將采集到的節肢動物放于密封袋中或分別放入裝有75%酒精的50mL離心管中,編號帶回實驗室。

1.3 節肢動物的分類

將采集到的節肢動物標本,在顯微鏡下進行分類鑒定,記錄下節肢動物的種類和數量,對于無法鑒定的樣本,進行編號記錄[5],輔以分子鑒定。

1.4 節肢動物的分子鑒定

1.4.1 基因組總DNA的提取 將采集的樣本用蒸餾水沖洗,放于濾紙上晾干后,使用天根細胞組織DNA提取試劑盒提取DNA,將提取的合格DNA樣品放于4°C備用。

1.4.2 PCR擴增 使用Hebert等設計的引物擴增線粒體基因組中COI基因的DNA條形碼序列,使用引物(MLepF1/R1)擴增采集樣本的特異片段,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

PCR反應的總體積為20μL,2×Taq PCR MasterMix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板1μL,dd H2O 8 μL。PCR反應條件為:94℃預變性3min;94℃變性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,共35個循環;最后72℃延伸10min。

將得到的PCR擴增產物進行基因片段片段純化和雙向測序。分別將使用引物(MLepF1/R1)得到的PCR產物進行凝膠電泳檢測。

1.5 數據處理

使用SPSS 26對數據進行統計。測序結果返回后,使用MEGA 10軟件對得到的正反向測序結果進行拼接,得到單條準確序列,采用BOLD數據庫中的Identification-animal identification[COI]功能對每條DNA條形碼序列進行比對,檢查鑒定結果及相似度數據。從NCBI數據庫中下載相應物種的DNA條形碼序列,使用MEGA 10軟件構建Neighbor-Joining樹,以進一步確定分子鑒定的結果。

2 結果與分析

2.1 涼山冕寧煙田節肢動物普查

經過采集和鑒定,涼山冕寧煙田共調查到節肢動物有2綱8目10科16種,隸屬昆蟲綱(Insecta)和蛛形綱(Arachnida)。其中昆蟲綱6目8科14種(表2),其中鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科害蟲種類最多,包括煙青蟲(Helicoverpaassulta)、甘藍夜蛾(Mamestrabrassicae)、疆夜蛾(Peridromasaucia)、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、小地老虎(Agrotisipsilon)、粘蟲(Mythimnaseparata)和弧金翅夜蛾(Thysanoplusiaorichalcea),鱗翅目害蟲種類豐富,數量較少,僅占節肢動物總量的0.52%。半翅目害蟲有煙蚜(Myzuspersicae)和煙粉虱(Bemisiatabaci),其中煙蚜種群數量最高,達到27.765頭/株。鞘翅目害蟲較少,包括泥紅槽縫叩甲(Agrypnusargillaceus)。天敵害蟲種類多,但數量低,包括隸屬雙翅目的食蚜蠅科(Syrphidae),隸屬脈翅目的中華通草蛉(ChrysoperlasinicaTjeder),隸屬膜翅目的煙蚜繭蜂(AphidiusgifuensisAshmead)和姬蜂科(Ichneumonidae),煙蚜繭蜂的數量較多為1.635頭/株(表2)。蛛形綱2目2科2種,隸屬寄螨目和蜘蛛目(表3)。

表2 煙田節肢動物發生數量

表3 煙田節肢動物物種組成

2.2 冕寧煙田節肢動物種類鑒定

對獲得的20個COI基因序列進行編輯、拼接,利用MEGA 10軟件構建系統發育樹,結果共得到3科8種(表4)。測序得到長度為636 bp的COI基因序列,將20個樣本的COI基因序列與BOLD數據庫中DNA條形碼序列進行比對,結果顯示,4個樣本的DNA條形碼序列與甘藍夜蛾標準序列的相似性均為100%,2個樣本的DNA條形碼序列與甘藍夜蛾標準序列的相似性均為99.5%,1個樣本的DNA條形碼序列與甘藍夜蛾標準序列的相似性均為99.3%。1個樣本的DNA條形碼序列與棉鈴蟲標準序列的相似性為100%,1個樣本的DNA條形碼序列與粘蟲標準序列的相似性為100%,5個樣本的DNA條形碼序列與疆夜蛾標準序列的相似性均為100%,1個樣本的DNA條形碼序列與小地老虎標準序列的相似性為100%,1個樣本的DNA條形碼序列與弧金翅夜蛾標準序列的相似性為100%,3個樣本的DNA條形碼序列與棉鈴蟲齒唇姬蜂標準序列的相似性為99.53%,1個樣本的DNA條形碼序列與泥紅槽縫叩甲標準序列的相似性為87.76%。

表4 物種鑒定比對

使用MAGA-10軟件構建系統進化樹(圖1),結果發現,20個樣本分屬于鱗翅目,膜翅目,鞘翅目3個目,同一物種以較高的置信度聚為一小支,如疆夜蛾的5條序列以100%的置信度聚在一起。

圖1 物種Neighbor-Joining聚類分析

3 討論

煙田節肢動物群落在煙草旺長期至成熟初期,群落多樣性最高,群落結構最穩定[18]。節肢動物群落的研究是煙草生長期有害生物綜合防控的基礎,目前,我國在煙田節肢動物方面開展了大量研究工作[19-22]。煙田節肢動物群落以刺吸類害蟲、食葉類害蟲及天敵為主,其中煙田節肢動物包括煙粉虱,煙蚜等優勢種害蟲以及煙蚜繭蜂、蜘蛛類等優勢天敵[23-24]。研究主要對7月份四川冕寧煙區的節肢動物種類和數量進行調查,對冕寧煙區節肢動物調查的不足部分進行補充。通過對四川冕寧地區節肢動物進行調查發現,冕寧煙田共有2綱8目10科16種(昆蟲綱6目8科14種,蛛形綱2目2科2種)。煙田害蟲8種,其中半翅目發生情況最重,包括煙蚜和煙粉虱,煙蚜的發生量遠高于煙粉虱,可能是由于在煙田煙蚜的種間競爭優勢更大。其他害蟲零星發生但也不能忽視,以避免次要害蟲上升為主要害蟲。煙田害蟲天敵6種,寄生性天敵以煙蚜繭蜂為主,煙蚜繭蜂在田間對煙蚜的寄生率一般在20%～60%,寄生率最高達90%左右,是煙蚜的一種優勢寄生性天敵[25],該天敵目前已在我國煙區大面積推廣應用。明確冕寧煙區節肢動物種類,尤其是害蟲和天敵的種類和數量,不僅能對煙田害蟲的綠色防控提供指導,同時為煙蚜繭蜂在冕寧煙田的推廣提供理論基礎。

掌握煙田節肢動物組成是開展煙田綠色防控的重要前提[26-27]。本試驗使用DNA條形碼技術初步鑒定出煙田節肢動物16種,該技術應用范圍廣泛,使用一對通用引物便可以滿足物種鑒定的需要,操作流程簡單,可有效識別大量物種。然而,DNA條形碼技術不能完全取代形態學分類,因此,在試驗過程中將二者進行結合,以提高調查結果的科學性和準確性。通過普查和DNA條形碼技術明確冕寧煙區的主要害蟲及天敵,對今后煙田綠色防控及天敵昆蟲在煙田的推廣具有重要的指導意義。但試驗仍存在不足之處,本試驗采取定點定株的方法對四川冕寧地區的節肢動物群落進行調查,主要針對移動性弱、對寄主依附性強的類群,存在采集到的類群少于其他方法的弊端[5]。且調查時間短,不能全面反應冕寧煙田節肢動物發生情況,今后可進行多年、多點和更加全面的調查。