稀釋與接種法測定五日生化需氧量的影響因素分析

張 麗

（山西省陽泉生態環境監測站，山西 陽泉 045000）

五日生化需氧量是在一定條件下，微生物分解水中某些可氧化的物質，特別是分解有機物的生物化學過程消耗的溶解氧量。在生態環境監測中，五日生化需氧量是水質有機污染綜合指標之一，是國家地表水、國家采測分離、污水監測中一個重要的監測指標，所以提高測定五日生化需氧量的準確度和精密度有很重要的意義。在對污染的水體和工業廢水等復雜水樣監測時，因為有很多因素的影響，使稀釋與接種法測定五日生化需氧量出現誤差。為了提高測定五日生化需氧量的準確度，本文從水樣的采樣及保存、水溫、pH、生化培養箱的溫度、固定劑的加入順序，稀釋倍數的確定、接種液的選擇等方面討論，并給出解決方案。

1 測定原理

生化需氧量是指在規定的條件下，微生物分解水中可氧化的物質，特別是在分解水中有機物的過程中，發生的生物化學反應，消耗溶解氧。通常情況下，水樣充滿完全密閉的溶解氧瓶中，在20 ℃±1 ℃的暗處培養5 d±4 h，分別測定培養前后水樣中溶解氧的質量濃度，由培養前后溶解氧的質量濃度差，計算每升樣品中消耗的溶解氧量，以BOD5形式表示[1]。

目前，在標準HJ 505—2009 中，稀釋與接種法測定五日生化需氧量有4 種方法：非稀釋法、非稀釋接種法、稀釋法、稀釋與接種法[1]。

2 研究方法

主要儀器：生化培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；虹吸管；250 mL 溶解氧瓶；25 mL 酸式滴定管；100 mL 量筒；

主要試劑：硫酸錳、堿性碘化鉀-疊氮化鈉、濃硫酸、重鉻酸鉀溶液、淀粉溶液、（1+5）硫酸、三氯化鐵溶液、氯化鈣溶液、磷酸鹽溶液、硫酸鎂溶液、0.01 mol/LNa2S2O3溶液。

測定方法：稀釋與接種法測定五日生化需氧量。

3 方法影響因素

3.1 采樣及保存

樣品需要采集到1 000 mL 棕色瓶中，不能有氣泡，不能采集到塑料瓶或其他玻璃器皿中。水樣要溢出棕色瓶2 s 后，密封試樣。試樣中不能引入新的氧氣。24 h 之內完成實驗室分析測試。24 h 不能分析，冷凍保存，冷凍樣品需提前解凍、均質化和接種。用稀釋水做全程序實驗空白，運送回實驗室。全程序空白溶解氧質量濃度要小于0.5 mg/L，否則應查污染來源。

3.2 水溫

水溫和溶解氧是成反比的，水溫低，溶解氧高；水溫高，溶解氧低。水溫要控制在20 ℃左右。冬天較清潔的水樣中溶解氧往往是過飽和的，并且水溫低，應該將水溫升至20 ℃左右，充分振搖，并開塞放氣，趕出飽和溶解氧后再測定。夏天水樣水溫高，使水樣降溫到20 ℃，充分振搖，使水樣和空氣中氧分壓接近平衡[3]。

3.3 pH 值

大多數微生物在酸性和弱堿性溶液中更容易繁殖生長。用pH試紙對水樣pH進行范圍測定。水樣pH要控制在6.5～7.5，用酸或堿調整到6.5～7.5。但酸或堿的加入量不能超過水樣體積的0.5%。一般調節到水樣pH=7.2。稀釋水和接種稀釋水的pH 也應該控制在7.2。

3.4 生化培養箱溫度

生化培養箱溫度要嚴格控制在20 ℃±1 ℃，每相差1 ℃，測定誤差為5%左右。用連續溫度記錄儀掌握培養期間的溫度。做實驗之前，要提前4 h 把生化培養箱打開，設定好溫度。水樣用虹吸管分成2 份，一份在15 min 后測定溶解氧，一份放入生化培養箱5 d±4 h 后測定溶解氧。注意添加封口水，防止空氣中氧進入溶解氧瓶。避光，防止試樣中藻類產生溶解氧。從樣品放入培養箱起計時，培養5 d±4 h 后測定。

3.5 固定劑加入順序

測定過程中，先加硫酸錳，再加堿性碘化鉀-疊氮化鈉[2-3]。如果做樣人員將硫酸錳和堿性碘化鉀-疊氮化鈉的順序加反，則會造成測定的溶解氧不準確。

3.6 稀釋水

對于某些地表水和大多數工業廢水，因含有較多的有機物，需要稀釋后再培養測定，以降低其濃度和保證有足夠的溶解氧。為了保證水樣稀釋后，有足夠的溶解氧，稀釋水通常要通入空氣或氧氣進行曝氣，使稀釋水中溶解氧接近飽和。稀釋水中需要加入三氯化鐵溶液、氯化鈣溶液、磷酸鹽溶液、硫酸鎂溶液，以保證微生物的生長。稀釋水要控制溫度為20 ℃，曝氣至少1 h，溶解氧質量濃度達到8 mg/L 以上。曝氣過程中，防止污染物進入水體中。稀釋水的濃度不能過飽和，使用前需開蓋1 h，在24 h 使用完畢。接種稀釋水空白值要小于1.5，否則應檢查污染源。

3.7 稀釋倍數

遇見復雜的水樣，用稀釋法或接種稀釋法測定五日生化需氧量是很重要的方法。有些水樣有機物含量高，直接測定的話，五天培養后的水樣加入硫酸錳和堿性碘化鉀-疊氮化鈉后，水樣成白色絮狀沉淀，說明水樣中有機物含量高，此培養液剩余溶解氧為零，應加大稀釋比。水樣需要重新稀釋，重新測定。

確定合理的稀釋倍數是成功測定BOD5的關鍵之一，稀釋的倍數一般以五日培養后消耗的溶解氧占原有溶解氧的40%～70%為宜。水樣稀釋后，應滿足五天培養過程中，溶解氧消耗量不小于2 mg/L，五天后測定溶解氧不小于2 mg/L，兩個條件同時滿足，測定數據才準確。水樣不稀釋的話，要滿足五天后測定溶解氧不小于2 mg/L 這個條件。以質控樣200265（36.9±3.3）、200263（62.6±3.9）為例，探討稀釋倍數的確定，結果見表1。

表1 不同稀釋倍數條件下質控樣的測定結果

3.8 接種液

對于一般的地表水、污水廠出口的水不含或少含微生物的工業廢水的測定，需要接種，引入微生物，創造有利于微生物生長的環境，以利于能分解廢水中有機物的微生物。分別選擇市污水廠進口的污水和工業廢水為接種液，測定接種稀釋空白。結果見表2。

表2 接種液選擇測定結果

市污水廠進口為稀釋接種空白，空白值小于1.5，滿足需要，有利于微生物繁殖生長。以工業廢水為稀釋接種空白的話，空白值大于1.5，不滿足要求，不利于微生物繁殖生長。所以選擇接種液的時候，要選擇城鎮生活污水廠污水進口。

3.9 CODCr 和BOD5 的關系

水樣中，測定CODCr時，采用的是強氧化劑，水樣中可被氧化的有機物占到85%～95%，同一個水樣中CODCr值＞BOD5值。

在做質控樣的時候，選用環保部的三個標準樣品和2021 年第一季度國家能力驗證樣品SMP 2021—7699 進行CODCr和BOD5的測定，結果見表3。SMP 2021—7699 通過國家能力驗證，結果為滿意。從表3可以看出，BOD5值=0.7×CODCr值。

表3 BOD5 測定值和CODCr 測定值相關性表

對于污染程度嚴重的水樣，例如，生活污水、工業廢水，CODCr值=（2.5/3.5）×BOD5值[5]。

3.10 干擾的消除

1）如果有亞硝酸鹽干擾，可預先配置堿性碘化鉀-疊氮化鈉消除干擾。

2）如果水樣中含氧化性物質（如游離氯等），可加入適量硫代硫酸鈉消除干擾。

3）如果水樣中含重金屬等有毒物質時，可以提高稀釋倍數減少有毒物質的濃度或者使用經過馴化的微生物接種液的稀釋水進行稀釋。

4 結語

稀釋與接種法測定水樣中BOD5為一種經驗方法，該方法是利用微生物分解水中有機物過程中消耗溶解氧的量來測定的，所以該方法與微生物有密切關系，微生物生長繁殖又與環境因素息息相關。本文從水樣的采集、保存、水溫和pH 的控制、生化培養箱的溫度、稀釋水的影響、稀釋倍數的確定、CODCr和BOD5的關系、干擾的消除方面探討了稀釋與接種法測定，并提出了相應的解決方法，具有很好的適用性和可操作性[5]。