下調胰島素樣生長因子抑制miR-767-5p的表達對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲及上皮間充質轉化的影響

劉海英 陳峰 姚嘉

海南省人民醫院1乳腺外科，2綜合介入科（海口 570000）

乳腺癌是婦女最常見的癌癥，全世界每8 名婦女中約有1 例有患乳腺癌的累積風險［1］。乳腺癌也是婦女癌癥死亡的主要原因，占癌癥病例的25%，占癌癥相關死亡的15%［2］。多數乳腺癌病例在早期是可以治療的，但約有20% ～ 30%患者的癌細胞會從原發部位擴散到其他部位，如骨骼、腦、遠處結節、肝、肺和胸膜轉移［3-6］。目前臨床上對于乳腺癌的治療方法主要包括化療和放療等非特異性的治療方法，缺乏針對性的治療方法。因此，需要找到新的治療靶點用于乳腺癌的治療。

miRNAs 是調節基因表達的關鍵分子，能夠影響細胞的生物學功能，促進疾病的發生和發展。在癌癥中，許多miRNAs 作為致癌基因或腫瘤抑制劑發揮作用，促進腫瘤的生長、入侵和血管生成［7］。胰島素樣生長因子-1（insulin like growth factor，IGF1）是一種調節乳腺發育的小多肽，在癌癥的發展中具有多種生物學效應，能調節干細胞、基因組穩定性、細胞代謝和血管生成等［8］。在乳腺癌中，IGF1能誘導腫瘤細胞增殖和遷移，其高表達與乳腺癌的風險增加相關，因此IGF1 有望成為乳腺癌治療的新靶點［9］。本實驗室前期通過生物信息學方法篩選出差異表達的miRNA 即miR-767-5p 顯著上調及預測靶基因為IGF1，并通過實驗證明miR-767-5p 與IGF1靶向結合［10］。本研究以差異表達最明顯的乳腺癌細胞（MCF-7）為研究對象，以miR-767-5p為切入點，觀察抑制miR-767-5p的表達對乳腺癌增殖、侵襲和EMT的影響，探討其對乳腺癌侵襲轉移和 EMT的作用及分子機制，為尋找新的乳腺癌治療靶點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料MEM 培養基，胎牛血清均購自美國Gibco；MEM Non-Essential Amino Acids Solution（NEAA）購自美國invitrogen；Sodium Pyruvate 購自日本Sigma；完全培養基：MEM+10%FBS+1%Glutamax+1%NEAA+1%Sodium Pyruvate+終濃度為0.01 mg/mL 的insulin；PBS 和0.25%胰蛋白酶均購自美國TBD；重組人胰島素溶液購自武漢普諾賽生命科技；結晶紫購自上海碧云天生物技術；甲醛購自上海麥克林生化科技；Lipofectamine2000 購自上海一基生物科技；matrigel 購自吉林吉春制藥；Tween-20 和BCA 蛋白濃度測定試劑盒，RIPA（強）組織細胞快速裂解液，十二烷基硫酸鈉（SDS ），TEMED ，過硫酸銨購自北京索萊寶科技；蛋白質Marker 購自Biohelix；E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9、IGF1、GAPDH 一抗和Goat anti-Rabbit IgG 二抗購自武漢貝茵萊生物科技；MCF-7 購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養MCF-7 細胞轉接至完全培養基中在37 ℃、5% CO2的條件下培養。在80% ～ 90%的細胞密度下，0.25%的胰蛋白酶進行細胞傳代。

1.2.2 細胞轉染及轉染效率驗證根據miR-767-5p 序列（UGCACCAUGGUUGUCUGAGCAUG），分別合成miR-767-5p inhibitor、inhibitor-NC，使用Lipofectamine?3000 轉染試劑進行轉染。正常細胞作為空白對照組，轉染miR-767-5p inhibitor 作為實驗組，轉染inhibitor-NC 作為陰性對照組，采用熒光染色檢測轉染效率。

1.2.3 CCK-8 實驗檢測細胞的增殖能力將細胞按照5 000 個細胞/孔接種于96 孔板中，分別培養24、36、48、60 和72 h 后向孔中加入10 μL CCK-8試劑，并于37 ℃下培養6 h。使用微板讀數器測定450 nm 波長下的光密度。

1.2.4 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力在試驗開始前24 h，用無血清培養液替換培養各組別的細胞。在接種之前，用 PBS 將24 孔板及 Transwell小室浸泡5 min。將80 μL matrigel 凝膠涂于小室內，37 ℃ 培養30 min。消化細胞接種到Transwell小室內，下層的24 孔板中加入0.75 mL 含10% FBS 的培養液，置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養48 h。PBS清洗后加入1 mL 4%甲醛溶液，室溫固定20 min。吸去固定液，PBS 洗滌后加入1 mL 0.5%結晶紫溶液，染色30 min 后，使用棉簽將 Transwell 小室沒有遷移的細胞擦去后將其放置于200 ×顯微鏡下，對其進行觀察，并對每個視野中的細胞數進行統計。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力先用marker筆在6 孔板背后，豎著均勻畫線。在每孔中加入1 × 106個細胞，次日用槍頭在背后的直線垂直劃痕。用PBS 沖洗去除劃下的細胞，按照不同分組處理細胞，加入無血清培養液在37 ℃和5% CO2條件下繼續培養。在0、48 h 分別拍照，在0、48 h 分別拍照，在拍照的時候，將畫線和劃痕的交點作為觀察點，定點觀察。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-767-5p和IGF1 的結合將野生型（WT）或突變型（MUT）IGF1 的3′UTR 擴增并克隆到pmirGLO 載體中。然后，將HEK293T 細胞接種在96 孔板上，并與WT 或MUT 螢光素酶質粒和miR-767-5p 或對照miRNA共轉染。使用雙熒光素酶報告物測定系統來測量熒光素酶活性。

1.2.7 IGF1 相對表達量檢測用 Trizol 法提取總RNA，Takara 逆轉錄試劑盒逆轉錄獲得cDNA 并進行qPCR 檢測IGF1 相對表達量，以GAPDH 為內參，用2-△△Ct法計算基因相對表達量。其引物序列如下：IGF1（F：5′-TGTCCTCCTCGCATCTCTTCT-3′；R：5′-CCATACCCTGTGGGCTTGT-3′）；GAPDH（F：5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′；R：5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′）。

1.2.8 Western blot 檢測取出培養箱中的細胞，將培養液吸去后，對預冷的PBS 進行兩次洗滌，然后按照每1 × 106個細胞加入200 μL 裂解液的比例加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液。BCA試劑盒檢測蛋白濃度后每孔上樣20 μg 蛋白。制備SDS-PAGE 凝膠并電泳，使用PVDF 膜濕轉轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜。一抗E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、IGF1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）和膜室溫孵育1 h。用PBST 清洗3 次，每次5 min。隨后1∶10 000 稀釋二抗（含HRP 標記），再次孵育清洗。全自動化學發光分析儀檢測，并通過TANON GIS 軟件讀取條帶灰度值。

1.3 統計學方法數據資料以SPSS 19.0軟件為主要工具進行方差分析，實驗數據以均數±s表示。兩組間樣本采用單因素方差分析及t檢驗。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熒光檢測轉染效率Lipofectamine?3000 轉染試轉染乳腺癌細胞后，可根據細胞內有無綠色熒光判斷轉染是否成功。熒光顯微鏡觀察發現，miR-767-5p inhibitor 和inhibitor-NC 轉染組細胞內均可見綠色熒光，Control 組無熒光信號，表明miR-767-5p inhibitor 和inhibitor-NC 均能成功轉染乳腺癌細胞。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡觀察轉染效率（100 ×）Fig. 1 Transfection efficiency with a fluorescence microscope（100 ×）

2.2 抑制miR-767-5p的表達對細胞增殖的影響CCK-8實驗結果顯示，與Control組和inhibitor-NC組相比，miR-767-5p inhibitor 組顯著抑制MCF-7 細胞的增殖（P＜ 0.05），見圖2。

圖2 抑制miR-767-5p 的表達對細胞增殖的影響Fig. 2 Effect of suppression of miR-767-5p expression on the cellular proliferation of MCF-7 cells

2.3 抑制miR-767-5p的表達對細胞侵襲的影響由侵襲實驗結果可知，Control 組侵襲細胞數為（245.33 ± 5.69）個，miR-767-5p inhibitor組、inhibitor-NC 組侵襲細胞數分別為（128.67 ± 6.35）、（248.67 ±8.33）個。與Control 組和inhibitor-NC 組比較，miR-767-5p inhibitor 組對MCF-7 細胞侵襲數明顯減少（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 抑制miR-767-5p 的表達對細胞侵襲的影響Fig. 3 Effect of suppression of miR-767-5p expression on the cellular invasion of MCF-7 cells

2.4 抑制miR-767-5p的表達對細胞遷移的影響劃痕試驗顯示，劃痕48 h 后，miR-767-5p inhibitor組對MCF-7 細胞的遷移較Control 組和inhibitor-NC組存在明顯的抑制作用，見圖4。

圖4 抑制miR-767-5p 的表達對細胞遷移的影響Fig. 4 Effect of suppression of miR-767-5p expression on the cell migration of MCF-7 cells

2.5 抑制miR-767-5p 的表達對遷移相關蛋白MMP-2 和MMP-9 的蛋白表達的影響與Control組和inhibitor-NC 組比較，miR-767-5p inhibitor 轉染組的MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平顯著降低（P＜ 0.05），Control 組和inhibitor-NC 組的MMP-2 和MMP-9 蛋白表達差異無統計學意義（P＞ 0.05），進一步表明miR-767-5p inhibitor 可以抑制MMP-2 和MMP-9 的表達。見圖5。

圖5 MMP-2 和MMP-9 的蛋白表達水平Fig. 5 The protein expression levels of MMP-2 and MMP-9

2.6 miR-767-5p 和IGF1 的靶向結合關系TargetScan 數據庫預測miR-767-5p 和IGF1 具有結合位點（圖6A）。RT-qPCR 檢測敲除miR-767-5p 后，IGF1 的表達水平，結果顯示，敲除miR-767-5p 后，IGF1 的表達水平顯著升高（圖6B）。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與pLUC-IGF1-mut 共轉染時，突變體3′-UTR 載體的活性不受miR-767-5p mimics 同時轉染的影響（圖6C）。

圖6 乳腺癌中miR-767-5p 和IGF1 的靶向結合Fig.6 Targeted binding of miR-767-5p and IGF1 in breast cancer

2.7 抑制miR-767-5p 的表達對IGF1 表達的影響與Control 組和inhibitor-NC 組比較，miR-767-5p inhibitor 轉染組IGF1 的蛋白和mRNA 表達水平顯著降低（P＜ 0.05），Control 組和inhibitor-NC 組的MMP-2 和MMP-9 蛋白表達差異無統計學意義（P＞ 0.05），這表明miR-767-5p inhibitor 可以抑制IGF1 的表達。見圖7。

2.8 抑制miR-767-5p 的表達對EMT 相關蛋白Ecadherin 和N-cadherin 表達的影響與Control 組和inhibitor-NC 組比較，miR-767-5p inhibitor 組顯著提高E-cadherin 蛋白表達（P＜ 0.05），顯著降低N-cadherin蛋白表達（P＜ 0.05），Control組和inhibitor-NC 組的E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達差異無統計學意義（P＞ 0.05），這進一步表明miR-767-5p inhibitor 可以影響E-cadherin 和N-cadherin 的表達。見圖8。

圖8 E-cadherin 和N-cadherin 的蛋白表達水平Fig. 8 The protein expression levels of E-cadherin and N-cadherin

3 討論

癌癥在全球所有疾病中病死率居第2 位，僅次于心腦血管疾病，90%的癌癥死亡是由于腫瘤轉移引起的［11］。其中乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤，是導致婦女疾病死亡的主要原因［12］。乳腺癌容易發生轉移，細胞自身可以通過血管生成獲得營養和氧氣，然后轉移到其他新組織形成繼發性腫瘤，增加乳腺癌治療的難度。轉移性乳腺癌5 年的生存率為25% ～ 30%，預后較差［13］。因此需要迫切找到治療乳腺癌的靶點，miRNA 能調節基因表達，許多miRNAs 作為致癌或抑癌基因發揮作用，本課題組確定miR-767-5p 在乳腺癌中異常表達，先前研究發現，miR-767-5p 通過靶向SUZ12 抑制神經膠質瘤增殖和轉移［14］；LINC-PINT通過下調miR-767-5p 誘導TET2 表達抑制甲狀腺癌癥侵襲性［15］；Circ-SMARCA5 靶向miR-767-5p 抑制多發性骨髓瘤的進展［16］；CircNOL10 通過吸收miR-767-5p 調節SOCS2/JAK/STAT 信號抑制乳腺癌癥進展［17］，以上研究提示miR-767-5p 在多種癌癥中均發揮作用。癌細胞遷移和侵襲是腫瘤轉移的重要組成成分，是腫瘤癌癥患者死亡的主要原因［18-19］。抑制癌細胞的遷移和侵襲可以延緩腫瘤的惡化［20］。在本實驗中，Transwell 和侵襲實驗結果表明轉染miR-767-5p 抑制劑后，乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力被抑制。這表明抑制miR-767-5p的表達通過抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲抑制腫瘤轉移。

腫瘤細胞通過血管生成積累營養物質，促進EMT，促進腫瘤生長。腫瘤周圍血管壁較弱，使其易進入血液和轉移。研究表明，與良性腫瘤相比，惡性腫瘤周圍新血管數量明顯增加［21］。EMT 是上皮細胞向間充質細胞轉化的過程，能有效地促進腫瘤細胞的生長、耐藥和增殖。EMT 改變了腫瘤細胞的類型，提高了腫瘤細胞降解基質的能力，削弱了腫瘤胞間結合力，腫瘤細胞轉移和侵襲能力增強，存活率升高。EMT 能夠使腫瘤細胞脫離原發灶或轉移灶，形成新的繼發轉移灶［22-23］。無數實驗證明EMT 使上皮細胞標志蛋白E-cadherin 表達下降，間質細胞標志蛋白N-cadherin 表達增加［24-26］。本研究中，轉染miR-767-5p 抑制劑后乳腺癌細胞中E-cadherin 蛋白的表達上調，N-cadherin 蛋白的表達下調。此外，轉染miR-767-5p抑制劑后MMP-2和MMP-9 蛋白表達水平以及IGF1 的蛋白和mRNA表達水平均下調。這一結果表明，抑制miR-767-5p 的表達可能通過抑制IGF1 抑制乳腺癌細胞發生EMT，并由此抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移。

綜上所述，抑制miR-767-5p 的表達能抑制IGF1 的表達，阻斷乳腺癌細胞EMT 過程并抑制其侵襲和遷移。miR-767-5p 可能成為乳腺癌治療的潛在靶標，有望用于乳腺癌轉移治療臨床應用。

【Author contributions】LIU Haiying performed the experiments and wrote the article. CHEN Feng performed the experiments. LIU Haiying and YAO Jia revised the article. LIU Haiying designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.