復方氨基酸注射液中胱氨酸含量的測定方法

文/喬曉芳 蔣芙蓉 劉再德 蘭香南 周慧

本文第一作者喬曉芳就職于河南省藥品審評查驗中心；通訊作者周慧和其他作者均就職于湖南科倫制藥有限公司。

本文建立了一種復方氨基酸注射液（18AA）中胱氨酸含量的測定方法——在堿性條件下，采用1，4-二硫代蘇糖醇將胱氨酸還原成半胱氨酸，生成的半胱氨酸與酸性茚三酮溶液反應，生成紅色產物，在560 nm 波長處測定吸光度，用對照品標準曲線法測定復方氨基酸注射液（18AA）中胱氨酸的含量。測定結果顯示胱氨酸濃度在0.0418 ～0.2088 mg/ml 范圍內線性關系良好（r=0.9992）; 平均加樣回收率為101.61%（RSD 為1.96%，n=9)。這證明本方法準確、重現性好，可用于復方氨基酸注射液（18AA）中胱氨酸的含量測定。

復方氨基酸注射液在臨床上應用廣泛，目前在臨床應用的品種主要有補充營養用氨基酸、小兒用氨基酸、腎病用氨基酸和肝病用氨基酸，適用人群包括老人、成人、兒童，主要以中心靜脈插管或由外周靜脈滴注，還有補充氨基酸的口服制劑在臨床應用[1-8]。復方氨基酸注射液（18AA）含必需氨基酸與非必需氨基酸，在臨床主要用于蛋白質攝入不足、吸收障礙等氨基酸不能滿足機體代謝需要的患者。鑒于當前質量標準中未對胱氨酸的含量進行測定[9-11]，特開展復方氨基酸注射液（18AA）中胱氨酸含量檢測方法的研究，便于全面控制該品種的質量。

1.試驗材料

1.1 儀器

UV2450 雙光束紫外-可見分光光度計，島津公司產。電子分析天平BP211D，北京賽多利斯儀器系統有限公司產。電子天平ES-1000HA，長沙湘平科技發展有限公司產。

1.2 樣品與試劑

復方氨基酸注射液，批號：C120426 C；規格：500 ml：25 g（總氨基酸）；湖南科倫制藥有限公司產。胱氨酸對照品，中國藥品生物制品檢定所提供。鹽酸為分析純。二硫代蘇糖醇為分析純。茚三酮為分析純。試驗用水為湖南科倫制藥有限公司自制。其他試劑均為分析純。

2.方法與結果

2.1 測定方法：

標準曲線制備：稱取胱氨酸對照品適量，用少量0.1 mol/L 鹽酸溶解后用水稀釋制成每1 ml 中約含0.5 mg 的溶液，分別精密量取1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml 置10 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取2.5 ml 稀釋后溶液置10 ml 量瓶中，加入酚酞指示液3 滴，再加10 mol/L 氫氧化鈉溶液50 μl 使溶液呈紅色，精密加入二硫代蘇糖醇溶液（取1，4-二硫代蘇糖醇40 mg，加水溶解并稀釋至25 ml）2.5 ml，用水稀釋至刻度，搖勻，在室溫放置30 min 后，精密量取1 ml 置25 ml 具塞試管底部，精密加入冰醋酸1 ml 和酸性茚三酮溶液（取茚三酮0.5 g，加冰醋酸6 ml 和鹽酸4 ml 使之溶解）1 ml，輕輕搖勻，密塞，在90℃水浴中準確加熱10 min，立即冷卻，最后精密加入乙醇15 ml，搖勻。在560 nm波長處測定吸光度，以吸光度與其相應的濃度計算回歸方程。

測定:精密量取復方氨基酸注射液2.5 ml 置10 ml 量瓶中，從上述“加入酚酞指示液3 滴”開始，依法操作，測定吸光度，由回歸方程計算胱氨酸的含量。

2.2 方法原理

在堿性條件下，采用1，4-二硫代蘇糖醇將胱氨酸還原成半胱氨酸，生成的半胱氨酸與酸性茚三酮溶液反應，生成紅色產物，在560 nm 波長處測定吸光度，用對照品標準曲線法測定注射液中胱氨酸的含量。

2.3 驗證

2.3.1 專屬性

空白溶液配制：按處方量稱取除胱氨酸以外的各原輔料，配制成溶液，精密量取2.5 ml 置10 ml量瓶中，按照前文“2.1”項下“加入酚酞指示液3 滴”起，同法操作。

對照品溶液配制：精密稱取胱氨酸對照品13.98 mg 置25 ml 量瓶中，先用適量0.1 mol/L 鹽酸溶解后，再用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.5 ml 稀釋后溶液置10 ml 量瓶中，按照“2.1”項下“加入酚酞指示液3 滴”起，同法操作。

供試品溶液配制：精密量取C120426 C 批復方氨基酸注射液（18AA）2.5 ml 置10 ml 量瓶中，按照前文“2.1”項下“加入酚酞指示液3 滴”起，同法操作。

掃描上述樣品，結果顯示對照品溶液和供試品溶液在560 nm有最大吸收，空白溶液基本無干擾。

2.3.2 線性范圍

精密稱取胱氨酸對照品（140624-200805）20.88 mg 置50 ml 量瓶中，先用適量0.1 mol/L鹽酸溶解后，再用水稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液。分別精密量取1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml 對照品貯備液置于10 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度。分別精密量取2.5 ml 稀釋后溶液置10 ml量瓶中，按照前文“2.1”項下“加入酚酞指示液3 滴”起，同法操作。結果見表1。

表1 胱氨酸含量測定——線性與范圍

結果表明胱氨酸濃度在0.0418 ～0.2088 mg/ml 范圍內線性關系良好。樣品測定濃度在0.1 mg/ml，在此范圍內。

2.3.3 空白回收試驗

低濃度樣品溶液配制（55%）：精密量取線性范圍項下對照品貯備液1.3 ml 置10 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻，精密量取2.5 ml 置10 ml 量瓶中，加空白溶液2.5 ml，按照前文“2.1”項下“加入酚酞指示液3 滴”起，同法操作。平行制備3 份樣品。

中濃度樣品溶液配制（100%）：精密量取線性范圍項下對照品貯備液2.5 ml 置10 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻，精密量取2.5 ml 稀釋后溶液置10 ml量瓶中，加空白溶液2.5 ml，按照前文“2.1”項下“加入酚酞指示液3 滴”起，同法操作。平行制備3 份樣品。

高濃度樣品溶液配制（120%）：精密量取線性范圍項下對照品貯備液3 ml 置10 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻，精密量取2.5 ml 稀釋后溶液置10 ml 量瓶中，加空白溶液2.5 ml，按照前文“2.1”項下“加入酚酞指示液3 滴”起，同法操作。平行制備3份樣品。

將上述樣品測得的吸光度用線性范圍項下的標準曲線計算含量，結果見表2。

表2 胱氨酸含量測定——空白回收試驗

表2 的結果表明該方法準確度好。

2.3.4 重復性試驗

精密量取復方氨基酸注射液（18AA）2.5 ml 置10 ml 量瓶中，按照前文“2.1”項下“加入酚酞指示液3 滴”起，同法操作。平行制備6 份。測定結果見表3。

表3 胱氨酸含量測定——重復性試驗

表3 的結果表明該方法重復性較好。

2.3.5 溶液穩定性試驗

精密稱取胱氨酸對照品12.62 mg 置25 ml 量瓶中，用少量0.1 mol/L 鹽酸溶解后，加水稀釋至刻度，分別精密量取0.5 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml 置10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取2.5 ml 置10 ml 量瓶中，按照前文“2.1”項下“加入酚酞指示液3 滴”起，同法操作。另精密量取復方氨基酸注射液（18AA）2.5 ml 置10 ml 量瓶中，同法測定（分別放置一定時間后再測定吸收值）。計算供試品中的胱氨酸含量。結果見表4。

表4 的結果表明本品在顯色反應完成后，吸收值有下降趨勢，所以應盡量在30 min 內測定。

2.3.6 耐用性考察

按照前文“2.1”項下方法，考察本試驗中反應溫度、時間不同對胱氨酸含量測定的影響。結果見表5。

表5 胱氨酸含量測定耐用性考察

從表5 的試驗結果可以看出，反應溫度在80℃～100℃、反應時間在5 ～15 min 范圍變化時，胱氨酸含量測定結果有一定的差異，耐用性不是很理想，但在90℃準確反應10 min 時該方法準確度、線性、重復性均好，這表明操作時需注意反應條件及反應時間。

2.3.7 樣品測定

取C120426 C、C120426 D、C120426 E 三批復方氨基酸注射液（18AA）樣品，分別按照前文“2.1”項下進行測定，反應溫度為90℃，反應時間為10 min。 結果見表6。

表6 胱氨酸含量測定結果

3.討論

在現有的復方氨基酸注射液（18AA）國家標準中均未收載胱氨酸含量的相關內容，但胱氨酸確為該產品的有效成分之一，增加胱氨酸含量檢測是有必要的。以上方法的線性、準確度、重現性均比較好，雖然耐用性不理想，但通過控制反應條件、加強檢驗人員的考核便能夠使檢驗結果穩定準確，不失為一種可行的測定方法。