酸棗仁皂苷A對小鼠前額葉皮層腺苷釋放及核苷轉運體的影響

魏 琳，李博林，姜曉娟，吳 琪 ，白金萍，楊曉峰，宋 伍*

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.沈陽藥科大學，沈陽 110016）

酸棗仁皂苷A（JuA）是酸棗仁中的主要活性成分。研究[1-3]表明，JuA具有廣泛的藥理作用，如鎮靜催眠、抗高血壓、降脂、抗炎、抗缺氧、增強免疫力和心臟保護等作用，其鎮靜催眠作用引起了研究人員的關注。盡管現有研究發現JuA可能通過激活GABA受體[4]或抑制谷氨酸釋放[5]發揮其中樞抑制作用，但其抑制機制至今尚未完全闡明。

腺苷是體內普遍存在的嘌呤核苷酸，它不僅是能量代謝的產物，而且還具有多種生物活性[6]。研究[7]表明，中樞神經系統（CNS）中的腺苷可誘導睡眠。因此，認為腺苷是促進大腦睡眠的物質，并且其濃度的改變將導致睡眠和覺醒的改變。人體內有2種主要類型的核苷轉運蛋白：平衡核苷轉運蛋白（ENT）和濃縮核苷轉運蛋白（CNT），負責尿苷和腺苷的跨膜轉運[8]。這2種轉運體在維持中樞神經系統中的尿苷和腺苷水平方面起著非常重要的作用。本文應用在體腦微透析技術觀察了JuA對小鼠自主活動和前額葉皮層（PFC）胞外腺苷釋放的影響，并考察了對腦內CNT和ENT蛋白表達的影響。本研究有望為JuA的作用機制研究提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 雄性昆明種小鼠，體質量18～22 g，購自中國醫科大學實驗動物中心。在室溫（21±2）℃下飼養小鼠，光照時間為12 h（從早上8:00－晚上8:00），適應環境保存1～2 d。實驗前將小鼠隨機分組，所有實驗均于8:00至17:00進行。

1.2 藥物與試劑 酸棗仁皂苷A購自上海源葉生物技術有限公司；腺苷標準品購自Sigma公司（美國）；乙腈（色譜純，＞ 99.7%）購自天津科美爾化學試劑發展中心；磷酸二氫鈉（分析純，＞99%）購自沈陽市第三試劑廠。

2 方法

2.1 實驗分組與設計 將36只小鼠隨機分成3組，每組12只：對照組（生理鹽水，腹腔注射），JuA組（40、80 mg/kg，腹腔注射）。小鼠腦透析實驗在自主活動箱中進行，即在進行微透析實驗的同時也進行自主活動測試。透析結束后，小鼠斷頭處死，取前額葉皮層組織進行Western blot實驗。

2.2 腦微透析手術及灌流 小鼠腹腔注射水合氯醛（350 mg/kg）麻醉后，固定于腦立體定位儀上。根據小鼠腦圖譜，將透析導管置于小鼠前額葉皮層中，在小鼠醒來并恢復正常后18～24 h開始微透析灌注。自動灌注泵通過軟塑料管與小鼠腦透析管一側相連，另一端與集水管連接。制備林格氏液（147 mmol/L NaCl， 2.2 mmol/L CaCl2，4 mmol/L KCl），用 0.22 μm微孔濾膜過濾。丟棄前1 h內流出的透析液，此后每15 min收集1次樣品。

2.3 腺苷的檢測 將20 μL透析液注入HPLC-UV檢測系統。色譜柱為反向碳18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為：0.02 mol/L乙腈，磷酸二氫鈉（2:98，pH = 3～4，磷酸調節）；檢測波長為260 nm；流速為1 mL/min；柱溫度范圍為室溫。

2.4 自主活動測試 小鼠運動活動盒大小為30 cm ×30 cm × 45 cm，盒內壁為黑色，盒子頂部裝有照相機和紅外光源。給藥后立即將小鼠放入盒中，自由移動10 min后記錄小鼠的運動活動，記錄持續30 min。

2.5 Western blot考察 前額葉皮層組織在細胞裂解緩沖液中勻漿，用于蛋白質提取。將其在100 ℃下煮沸5 min，在150 V的8% SDS-PAGE凝膠上電泳80 min，然后通過使用Trans-Blot半干轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將PDVF膜用5%脫脂奶在室溫下封閉2 h，然后與特異性一抗（CNT，ENT，稀釋比例均為1：500），4 ℃孵育過夜。然后將樣品在室溫下用二抗孵育2 h，加入熒光顯色劑。最終，用Image J軟件分析和量化圖像。

2.6 統計學方法 統計過程中使用SPSS 13.0統計軟件。將前3個連續透析樣品的腺苷含量作為基礎值（100%），給藥后每隔15 min的數據變化表示為基礎值的百分比。數據采用單因素方差分析結合LSD-t檢驗。 P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠前額葉皮層細胞外腺苷含量變化比較 見表1。

3.2 各組小鼠自主活動數比較 見表2。

3.3 各組小鼠CNT1和ENT1蛋白表達灰度值變化比較 見表3，圖1（插頁一）。

4 討論

本研究首次發現JuA可以促進小鼠前額皮質中腺苷的釋放，并同時降低小鼠的自主活動數。另外，研究發現，JuA對CNT1和ENT1蛋白表達無顯著性影響，提示JuA對核苷釋放的促進作用與2種轉運體的含量可能無直接關系。研究[9-13]表明，JuA具有鎮靜催眠作用，并對神經遞質、受體和睡眠相關參數產生影響。CAO J X等[14]用EEG測量大鼠睡眠參數，結果顯示，JuA可顯著延長總睡眠時間和快動眼睡眠（REMS），而對非快速眼動睡眠（NREMS）無顯著影響。

研究[15]表明，腦室內注射腺苷可以促進貓的睡眠，腺苷的全身給藥也可以增加動物的睡眠和EEG慢波活動。此外，通過抑制腺苷代謝酶增加腺苷水平可促進大鼠的慢波睡眠。相反，阻斷腺苷的合成可降低細胞外腺苷的濃度，有效減少睡眠[16]。腺苷受體A1和A2a在腺苷調節睡眠中起重要作用[17-19]。傳統的GABA受體激動劑已顯示出相對較多且嚴重的毒副作用。因此，基于腺苷機制的藥物將為失眠的治療提供新的選擇。

表1 各組小鼠前額葉皮層細胞外腺苷含量變化比較（x± s ，n = 12） %

表2 各組小鼠自主活動數比較（x± s ，n = 12） 次

表3 各組小鼠CNT1和CNT2蛋白表達灰度值變化比較（x± s ，n = 5） %

中樞神經系統的腺苷的水平受轉運蛋白ENT和CNT調控，其中ENT快速誘導核苷的跨膜轉運，而CNT作為Na+依賴性轉運體，轉運速度較慢。本實驗結果發現，JuA急性給藥對2種轉運體蛋白表達無顯著性影響，可見增加細胞外腺苷含量的作用并非通過對轉運體表達的影響，可能與JuA直接作用有關。