甘蔗鳳梨輪作對根際土壤細菌群落的影響

吳罡騰 朱劍輝 李榮喜 賀立紅 董斌 劉文

摘要：為了揭示甘蔗鳳梨不同耕作方式對根際土壤中細菌群落的影響，本研究借助高通量測序技術，對未耕作（CK）、甘蔗連作（S）、鳳梨連作（P）、甘蔗-鳳梨輪作（SP）和鳳梨-甘蔗輪作（PS）5種耕作方式的根際土壤樣品進行16S rDNA測序分析。結果表明，與未耕作組相比，甘蔗和鳳梨連作后OTU分別為1 207個和1 353個，土壤細菌的OTU呈上升趨勢；甘蔗和鳳梨輪作（PS、SP）后OTU下降，分別為1 067個和1 048個；輪作與連作相比，特有的OTU明顯降低。與連作相比，輪作可以提高酸桿菌門、髕骨菌門、未辨別出的AD3菌屬以及未辨別出的酸桿菌屬的相對豐度，同時能夠降低擬桿菌門、浮霉菌門、疣微菌門、黃色土源菌屬、念珠菌屬以及未辨別出的芽單胞菌屬的相對豐度。通過BugBase表型預測，輪作可以提高土壤中好氧細菌和細菌在生物膜形成上的相對豐度，同時能夠降低厭氧細菌的相對豐度。這些有益菌的富集，抑制了病原菌的活性，導致細菌菌落物種數量的減少和豐度的降低，影響土壤中的細菌群落結構組成。因此，甘蔗鳳梨輪作可以改善土壤中細菌的群落結構，有效緩解甘蔗/鳳梨的連作障礙。

關鍵詞：甘蔗；鳳梨；輪作；土壤細菌；群落結構；連作障礙

中圖分類號：S154.3；S182；S344.1文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）16-0202-08

收稿日期：2022-09-04

基金項目：廣東省高校重點科研平臺項目（編號：2019KZDZX2035、2020GCZX009）；廣東省甘蔗劍麻產業技術體系創新團隊項目（編號：2021KJ104-10）；廣東農工商職業技術學院熱帶作物應用技術協同創新中心建設項目（編號：XJZX1902）；廣州市基礎研究計劃基礎與應用基礎研究項目（編號：202102080555、202102080544）；廣東省普通高校特色創新項目（編號：2019GKTSCX055）。

作者簡介：吳罡騰（1998—），男，廣東梅州人，碩士研究生，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：1225539138@qq.com。

通信作者：董 斌，博士，副教授，主要從事作物學、園林植物應用研究，E-mail：bbeenn@163.com；劉 文，博士，講師，主要從事熱帶作物種質資源保護與利用研究，E-mail：wenliu@gdaib.edu.cn。

甘蔗和鳳梨是我國熱帶地區重要的2種熱帶經濟作物。甘蔗是一種重要的熱帶和亞熱帶無性繁殖作物，在全球多個地區都有廣泛種植，其糖產量約占目前世界糖總產量的80%^［1］。除了作為制糖原料外，它也是乙醇和柴油的最有效原料，已經被公認為重要的能源和生物燃料作物，其產量占世界生物燃料總產量的40%。此外，從甘蔗生產中也可獲得其他有價值的副產品，如紙張、生物酶等^［2］。鳳梨別稱菠蘿，含有大量的生物活性化合物、膳食纖維、礦物質和營養元素，此外它在抗炎、抗氧化活性、監測神經系統功能等方面也發揮著重要功能，對人體健康有不少的益處^［3］。國際市場對菠蘿的需求很大，僅在香蕉和柑橘之后，排名第三。其副產品可生產蛋白酶、纖維素納米晶體，也可以作葡萄酒、有機酸的原料，在食品、紡織工業等方面潛力巨大^［4］。

微生物是土壤中最活躍的組成部分，不僅推動著土壤中物質以及養分的循環轉化，同時也維持著土壤生態系統的穩定和平衡^［5］。細菌是土壤微生物中重要的組成部分，其群落結構組成的變化能夠反映土壤性質以及微生態的改變趨勢^［6］，還會直接影響農作物的生長和最終產量^［7］。不同經濟作物連作的研究結果表明，連作會導致土壤微生物群落的結構和土壤理化性質的變化。百香果連作會隨著年限的增加，導致土壤的pH值不斷下降，微生物類群會從細菌型向真菌型轉化^［8］；馬鈴薯連作會導致土壤細菌中變形菌門、放線菌門以及酸桿菌門等優勢菌門相對豐度的改變，并降低有益真菌如種群子囊菌門的數量^［9］；甘蔗連作會導致根際土壤氮和硫循環功能相關的細菌減少，有效氮含量、總硫含量、蔗糖含量以及最終產量降低^［10］；鳳梨連作則會導致土壤中細菌群落多樣性指數升高，提高門、屬水平土壤細菌群落的相對豐度，土壤pH值也隨之降低^［11］。

作物輪作是緩解連作障礙發生的有效防治方法之一^［12］，對土壤會產生積極影響，利于有益菌的富集，改善土壤的微生態和減少土壤病害的發生，能給農作物產量的增加和品質的提升提供助力。不同作物與甘蔗輪作后，可以顯著改善種植條件和降低作物病害的發生。甘蔗與花生輪作可提高有益菌數量和土壤酶活性^［13］，甘蔗與玉米輪作可提高土壤中全氮、有效磷等土壤養分含量^［14］，甘蔗與香蕉的輪作可促進香蕉生長，降低香蕉枯萎病的發病率^［15］，甘蔗與大豆的輪作則可增加細菌和古菌生物量并抑制硝化微生物的活性^［16］。關于與鳳梨輪作種植的報道則較少，但輪作后可以顯著改善作物的種植環境。鳳梨與桉樹輪作利于土壤團聚體形成、增大土壤透性^［17］，鳳梨與香蕉輪作可以顯著增加根際中具有生防作用和促生作用的有益菌數量^［18］。鳳梨與甘蔗之間進行輪作是一個比較成熟的輪作模式，前期已有研究表明，這種輪作方式可以提高菠蘿和甘蔗的產量和產值，同時也提高了地力，減少肥料的使用量，降低生產成本^［19］。

本研究利用高通量測序技術，通過比較不同耕作方式下，甘蔗/鳳梨輪作和甘蔗/鳳梨連作細菌群落之間的差異，分析根際土壤細菌群落結構的變化規律，旨在為改良甘蔗和菠蘿產區的土壤環境狀況、選擇出合理的耕作方式以及土壤中根際促生菌的開發和利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘蔗品種為桂糖49，鳳梨品種為臺農16。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 以甘蔗與鳳梨為試驗種植作物，試驗地點位于廣東省湛江市廣墾糖業現代農業中心（109°40′～110°25′E，21°00′～20°31′N）。于2019年2月和2020年2月開展種植試驗，設置未耕作作物組（CK）、鳳梨連作組（P）、甘蔗連作組（S）、鳳梨—甘蔗輪作組（PS）、甘蔗—鳳梨輪作組（SP）共5種耕作方式，采用隨機區組排列，進行3次重復試驗。

1.2.2 樣品采集 在2021年7月選擇不同耕作方式下的各區組，隨機采集附著于種植區作物地下部分的土壤樣品，做好對應標記后立即置于干冰中進行低溫保存，隨后將采集到的所有樣品及時送至北京百邁客生物科技有限公司進行測序。

1.2.3 建庫測序與數據預處理 提取樣品的總DNA后，根據全長引物序列合成帶有條形碼的特異引物，進行PCR擴增并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，對建好的文庫進行質檢，合格的文庫用PacBio Sequel進行測序。通過smrtlink分析軟件將PacBio Sequel下機數據導出為CCS文件，并根據條形碼序列識別不同樣品的數據并轉化為FASTQ格式數據。對PacBio Sequel下機數據導出的CCS文件進行數據預處理，進行CCS識別、過濾以及去除嵌合體，分別得到原始序列數據、過濾的序列數據以及最終的有效序列數據。

1.2.4 測序數據分析 使用Usearch軟件，選擇相似度水平不低于97.0%的測序序列進行聚類獲得分類操作單位（OTU）并繪制樣品的差異韋恩（Venn）圖；通過序列數、長度、覆蓋度、細菌稀釋曲線對測序數據進行評價；以SILVA為參考數據庫使用樸素貝葉斯分類器對特征序列進行分類學注釋，得到分類信息并統計不同樣品的群落組成，用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度后用R語言繪制不同樣品的群落結構圖；使用QIIME 2軟件對不同樣品細菌的α多樣性指數進行評估，包括ACE指數、Chao1指數、Shannon指數以及Simpson指數；以binary-jaccard算法計算不同樣品間的矩陣距離，構建非加權組平均法（UPGMA）聚類樹；利用主坐標分析（PCoA）法展示不同樣品的差異；基于不同樣本的OTU，使用BugBase軟件進行細菌的表型預測分析。

2 結果與分析

2.1 根際土壤細菌基因組測序評價

根際土壤細菌基因組測序結果見表1，通過不同樣品的序列數、序列長度等測序的參數對其進行評價。試驗中所有樣品經過質控后，樣品平均序列長度基本在1 400 bp以上，有效率都在85%以上（表1）。隨著測序數量的增加，不同樣品的稀釋性曲線均已趨于平緩（圖1），土壤中的細菌種類并不會隨測序數量的增多而顯著增加，表明各樣本測序量已經足夠充分。所有樣品的測序結果較好，可以進行后續數據分析。

2.2 不同耕作方式下土壤細菌OTU分布

根據97%的序列相似性水平進行聚類，獲得不同樣品的OTU，所有樣品共產生1 798個OTU。由圖2所有樣品的OTU可知，連作與未耕作組相比，甘蔗連作組的OTU數量較少，鳳梨連作組的OTU則較高，這表明甘蔗連作可減少土壤中細菌物種數量，而鳳梨輪作增加了土壤中細菌物種數量。輪作組的OTU數量均低于未耕作組和連作組，表明輪作能夠降低根際土壤中細菌的物種數量。

通過Venn圖的繪制，發現所有樣品共有的OTU為484個，占總體OTU的26.92%（圖3）。甘蔗連作與鳳梨連作的特有OTU分布中，P處理特有OTU為394個，S處理特有OTU為248 個，這表明對土壤中細菌數量的變化與連作的作物有關。輪作特有OTU分布中，SP特有OTU為259個，PS特有OTU為280個，這表明輪作時種植作物相同但前茬作物不同時，仍然存在一定程度的差異。與CK相比，不同耕作組特有的OTU也存在差異，PS獨有的OTU為291個，SP獨有的OTU為281個，S獨有的OTU為345個，P獨有的OTU為340個，這表明鳳梨與菠蘿之間輪作中特有OTU數量明顯低于甘蔗連作與鳳梨連作。因此，同連作相比，輪作可以有效降低根際土壤中的細菌特有種類數量。

2.3 不同耕作方式下根際土壤細菌α多樣性分析

不同耕作方式下，土壤樣品細菌群落α多樣性會發生不同程度的改變（表2）。所有樣品的覆蓋率均超過97%，表明絕大部分細菌種群都被檢測出來。根際土壤中細菌的菌群豐度可以通過ACE和Chao1指數進行估算，數值越高則代表著菌群的豐度越高。在不同耕作方式下，所有樣品的ACE指數為814.940 7～1 035.633 7，Chao1指數為 804.484 8～1 054.644 1。不同輪作下，發現甘蔗連作的ACE指數和Chao1指數都高于未耕作組，而鳳梨連作卻略低于未耕作組，這表明不同作物的輪作對根際土壤細菌的菌種豐度的影響不同，既可以降低也可以提高。與未耕作組、連作組相比，輪作組樣品的ACE指數和Chao1指數都有所降低，這表明輪作可以有效降低根際土壤細菌菌群的豐度。根際土壤中的物種多樣性則可用Shannon指數和Simpson指數來衡量，其數值越大則代表物種的多樣性越高。在不同耕作方式下，所有樣品的Shannon指數為6.656 6～8.403 8，Simpson指數為0.913 1～0.992 7。與未耕作組相比，其他4組處理樣品的Simpson指數都有所降低，表明連作和輪作都可以降低土壤中的菌落多樣性。甘蔗－鳳梨輪作的Simpson指數和Shannon指數遠低于其他樣品，而鳳梨—甘蔗輪作的Simpson指數和Shannon指數雖然有所降低，但基本和CK相差不大，這表明雖然輪作的作物相同，但輪作方式的不同也會造成土壤中細菌的多樣性變化不一致。

2.4 不同耕作方式下根際土壤細菌群落組成及相對豐度分析

在門分類水平的細菌群落組成上（圖4），不同耕作模式下的10個優勢菌門分別是變形菌門（22.28%～43.94%）、擬桿菌門（0.89%～24.13%）、酸桿菌門（7.02%～23.70%）、綠彎菌門（7.08%～15.13%）、疣微菌門（0.72%～9.31%）、放線菌門（6.72%～9.24%）、芽單胞菌門（1.30%～8.4%）、浮霉菌門（1.20%～3.84%）、厚壁菌門（0.42%～3.60%）、髕細菌門（2.11%～3.15%）。

這些優勢菌門中，耕作后變形菌門的相對豐度均高于未耕作組，這表明輪作與連作均可以提高土壤中變形菌門的相對豐度。不同耕作模式下酸桿菌門和髕骨菌門的相對豐度存在差異，在鳳梨連作中占比分別為20.51%、2.15%，甘蔗連作中占比為7.02%、2.36%，鳳梨—甘蔗輪作中占比22.70%、3.15%，甘蔗—鳳梨輪作中則達到了21.37%、2.69%，其中輪作的相對豐度均高于連作，這表明輪作與連作相比，能有效提高土壤中酸桿菌門和髕骨菌門的相對豐度。此外，與連作相比，輪作能降低擬桿菌門、疣微菌門和浮霉菌門的相對豐度。

在屬分類水平的細菌群落組成上（圖5），不同耕作模式下的10個優勢菌屬分別是褚氏桿菌屬（0.10%～22.91%）、黃色土源菌屬（0.06%～16.53%）、念珠菌屬（0.02%～7.48%）、未辨別出的酸桿菌（1.76%～7.42%）、未辨別出的JG30-KF-AS9菌屬（0.61%～7.14%）、未辨別出的AD3菌屬（2.45%～6.68%）、未辨別出的Elsterales菌屬（0.88%～5.35%）、未辨別出的芽單胞菌屬（1.03%～5.06%）、鞘氨醇菌屬（1.28%～4.94%）、苔蘚桿菌屬（2.03%～3.71%）。

在優勢菌屬中發現，與未耕作組相比，連作和輪作都會使褚氏桿菌屬的相對豐度升高，使未辨別出的AD3菌屬、未辨別出的芽單胞菌屬以及念珠菌屬的相對豐度降低。輪作與連作相比，可以提高未辨別出的AD3菌屬以及未辨別出的酸桿菌屬的相對豐度，同時也降低了黃色土源菌屬、念珠菌屬以及未辨別出的芽單胞菌屬的相對豐度。

2.5 土壤細菌群落組成PCoA及豐度UPGMA聚類分析

利用PCoA方法分析不同樣品，進一步展示不同耕作模式下樣品之間物種多樣性的差異（圖6）。其中主成分1以及主成分2對所有樣品的貢獻值分別為26.90%、16.03%。未耕作組與鳳梨連作組之間的距離最近，且與甘蔗連作組也相對較近；輪作組與未耕作組、連作組相隔較遠。基于β多樣性并采用UPGMA對所有樣品進行層次聚類，展示不同耕作模式下樣品之間物種組成相似性（圖7）。細菌群落結構相似度高的未耕作組、連作組聚類在一起，另一個分支聚類到的則是輪作組，這與主坐標分析的結果一致。

2.6 BugBase表型預測

基于16S rRNA基因序列，利用BugBase軟件預測不同耕作方式下土壤根際細菌群落的表型變化（圖8）。在好氧細菌相對豐度上，輪作組的相對豐度較其他處理組更高；而在厭氧菌相對豐度上，甘蔗連作、鳳梨連作與未耕作組的相對豐度較高，而輪作組都明顯低于其他處理組，尤其是其中的甘蔗—鳳梨輪作耕作模式；在兼性厭氧細菌相對豐度上，輪作組的相對豐度低于連作組；在生物膜形成上，連作組相對豐度明顯高于其他處理組，而連作組與未耕作組相比，有高有低，這可能由種植不同作物其根系分泌物導致。以上結果表明，與連作相比，輪作可以提高好氧菌的相對豐度，降低厭氧菌和兼性厭氧菌的豐度，并利于細菌細胞生物膜的形成。

3 討論

土壤是支撐地球生命的關鍵要素之一，而土壤微生物則是維持植物生物量生產和植物健康的基本組成部分之一。不同耕作模式對細菌群落的影響明顯^［20］。在耕作的土壤中，某些細菌類群數量增加，具有促進植物生長或降解潛在土壤化感物質的作用，與土壤修復密切相關，在緩解土壤病害方面有潛在的應用價值。長期連作導致土壤細菌群落特別是有益菌群的多樣性和豐度降低，細菌群落功能的簡化是土壤病害發生的主要原因^［21］。甘蔗連作會對不同質地土壤有機碳組分產生不同程度的影響^［22］，且連續連作甘蔗會對不同再生年限根際細菌群落特征產生影響^［23］；鳳梨連續連作會影響菠蘿園土壤中養分的比例，導致土壤中可培養微生物數量失調以及菠蘿產量的持續下降^［24］。

從OTU數量上看，輪作組的OTU數量均低于連作組和未耕作組，表明輪作后能夠有效降低土壤中細菌的種類數量，這與前人研究發現菠蘿—甘蔗輪作后可以降低土壤細菌數量的結論^［19］相符。根據OTU分布來繪制Venn圖以分析所有樣本之間共有、特有的OTU。所有樣品共有的OTU為484個，占總體OTU的26.92%，從輪作獨有的OTU分布可以發現，鳳梨甘蔗之間輪作中特有OTU數量明顯低于甘蔗連作與鳳梨連作，可以有效減少土壤細菌中特有菌群的數量。從細菌α多樣性相關指數來看，連作和輪作都可以有效降低土壤中的菌落多樣性，而輪作則可以有效降低菌群豐度。此外本研究發現，甘蔗—鳳梨輪作比甘蔗連作的降低幅度大于鳳梨—甘蔗輪作比鳳梨連作的降低幅度，這表明即使輪作種植相同作物時，種植順序的先后也會影響土壤中細菌的多樣性。因此，與連作相比，鳳梨與甘蔗輪作可以有效減少根際土壤細菌物種數量并降低物種豐富度。

種植作物的改變可以為某些特異性細菌提供適宜生存環境，而細菌的富集或減少又會影響到種植作物的生長^［25］。與連作不同的是，輪作可以增強有益菌落的富集，并抑制病原菌存活，可實現作物最終穩產增產的目標^［26-27］。本研究通過分析不同耕作模式下的根際土壤細菌群落組成結構及各分類菌落的相對豐度，發現輪作與連作相比，不僅能有效提高土壤中酸桿菌門、髕骨菌門、未辨別出的AD3菌屬以及未辨別出的酸桿菌屬的相對豐度，同時還降低了土壤中擬桿菌門、疣微菌門、浮霉菌門、黃色土源菌屬、未辨別出的芽單胞菌屬和念珠菌屬的相對豐度。這些富集在作物根際土壤附近的菌種，發揮著不同的作用。發揮積極作用的細菌可以有效改善土壤條件，利于作物的生長。酸桿菌門已經被證實可以抑制外界土壤中pH值的降低，且與鐵循環、單碳化合物代謝和植物殘體降解有關^［28］；放線菌門可以提高花椒抗外界脅迫的能力^［29］。但是一些病原菌的富集則不利于作物生長，甚至會導致作物發生病害。其中有研究發現，黃色土源菌屬可能與一部分植物病害的發生有關，如在患有黑穗病谷子和發病小麥的根際土壤中會顯著富集，并發現不同的谷田輪作模式中這類菌屬則會明顯減少^［30］；念珠菌屬在土壤中顯著占優的時候，可能會導致單一化群落結構而引起土壤微生態失調，在長期連作的茶樹中發現隨著種植時長的增加這種菌屬的相對豐度也隨之增加^［31］。此外，放線菌門、浮霉菌門、疣微菌門、浮霉菌門相對豐度升高利于植物對肥料中養分的吸收，它們都是好氧堆肥過程中共享的優勢菌門，彼此之間存在一定的競爭關系^［32-33］。因此，與輪作相比，甘蔗與鳳梨之間進行輪作能夠提高有益菌種的富集，減少病原菌的富集。

通過PCoA及UPGMA聚類分析，本研究發現，未耕作組與連作組的根際土壤細菌組成相似性高，表明連作總體上并不會導致群落結構組成發生明顯的改變，這可能是因為連作時間較短^［34］。此外，本研究還發現，鳳梨連作組與未耕作組相似性更高，表明種植鳳梨對土壤的改變能力較弱。前茬種植的農作物對后茬種植作物的生長產生影響，這主要是土壤中水分含量、養分和可利用物質發生了改變，而適宜的輪作順序可增大土壤的利用率以及農作物產量的提高。本研究發現，甘蔗對土壤微生物的早期影響較大，即使后續種植了鳳梨，其改變土壤的能力很有限，細菌的結構組成等都沒有產生太大變化；而鳳梨對土壤微生物的早期影響較小，在后續種植甘蔗后細菌的結構等都發生了較大變化。這表明雖然輪作植物相同，但種植先后的不同對其菌群相對豐度的影響也不一樣，而這可能與前茬作物對土壤的影響程度有關^［25］。

BugBase表型預測是一種預測復雜微生物組內功能途徑的生物水平覆蓋以及生物可解釋表型的方法。在BugBase表型預測上，好氧、厭氧以及兼性厭氧特征性狀類群上，輪作組好氧菌落相對豐度較高且厭氧菌落較少，連作組的兼性厭氧菌落相對豐度最高，好氧菌落與未耕作組區別不大。生物膜形成表型相對豐度的增加，對不利的環境脅迫更具有耐受性^［35］。在生物膜形成表型上，輪作組明顯高于其他組，這表明輪作可以改變土壤中微生物類群中細菌表型，而這種表型的轉移可以使細菌群落更適應土壤微生態環境。因此，輪作可以改善土壤中的通氣情況，利于好氧菌如放線菌等的富集，降低厭氧菌如浮霉菌門等的相對豐度，提高菌落耐受性，從而更利于植株的生長。前人研究發現，與菠蘿連作、甘蔗連作相比，進行輪作后在減少土壤中厭氧菌數量的同時，還可有效改善土壤的通氣情況并抑制病原厭氧細菌的活性^［36］，本研究得出的結論與之基本一致。

本研究主要是通過高通量測序手段，去探究土壤中細菌群落組成的變化，但是土壤的微生態是復雜的，因此需要開展更多的相關研究，如研究根際土壤中真菌的群落結構、種植作物的根際分泌物與土壤微生物之間的互作模式等。這些工作的開展，對甘蔗與鳳梨在不同耕作方式下土壤微生態功能的研究都具有重要意義。

4 結論

本研究發現進行甘蔗與鳳梨輪作處理，可以改變原本土壤微生物群落結構組成，其改善土壤微生物群落的能力比連作更強?；赑acBio測序平臺，各處理的根際土壤細菌之間各項數值比較后發現，輪作能夠降低土壤中細菌的數量，影響了甘蔗與鳳梨種植區根際土壤菌群優勢菌門（屬）的相對豐度，在富集有益菌的同時降低了病原菌的數量。進行功能預測發現，輪作可以進一步提高好氧菌落在細菌菌落中的比例，降低厭氧菌落在細菌菌落中比例，并更利于細菌生物膜的形成，能夠改善土壤中的通氣環境。此外，本研究還發現，前茬植物對輪作的影響也不同，其中前茬種植甘蔗對土壤細菌結構構成的影響更大。目前，甘蔗與鳳梨輪作的根際土壤微生物細菌門（屬）之間的互作模式尚不清楚，而且在輪作模式下真菌等其他微生物的影響也亟待更多的研究結果。

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