銅脅迫對蘋果幼苗生長及生理特性的影響

王佳樂 步凡 何佳麗 呂德國

摘要：通過研究不同供銅（Cu）水平對蘋果幼苗生長、光合作用、Cu富集情況和氧化應激反應的影響，探究蘋果苗Cu脅迫閾值，旨在為蘋果抗逆栽培提供理論指導。以寒富蘋果為試材，設置不同濃度（60、180、300、600、900 mg/kg）Cu處理，處理后60 d取樣，測定幼苗各組織生物量、根系形態、光合特性、各器官Cu含量以及總Cu含量、活性氧、抗氧化物含量和抗氧化物酶活性。結果表明，當Cu脅迫濃度超過300 mg/kg時，幼苗各器官生物量顯著降低，根系形態指標（總根長、根總表面積、根總體積）、葉片凈光合速率、氣孔導度、PSⅡ最大光化學效率、光合性能指數均呈下降趨勢。各組織Cu含量為根＞葉＞莖。隨著Cu濃度提高，幼苗各組織中活性氧物質積累，總硫醇、可溶性酚、抗壞血酸等物質含量及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等酶活性以300 mg/kg為臨界點，呈先增高后降低趨勢。

關鍵詞：銅；蘋果；脅迫；幼苗生長；生理響應

中圖分類號：S661.101文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）16-0105-08

收稿日期：2022-05-15

基金項目：遼寧省興遼英才計劃-青年拔尖人才項目（編號：XLYC1907105）；遼寧省教育廳科學研究經費項目（編號：LSNQN201916）；國家現代農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-28）。

作者簡介：王佳樂（1998—），男，甘肅平涼人，碩士研究生，主要從事果樹栽培與生理生態研究。E-mail：wjl1655294867@163.com。

通信作者：何佳麗，博士，副教授，主要從事果樹栽培與生理生態研究。E-mail：hejiali1017@163.com。

近年來由于工業廢料排放，化肥、農藥的過量施用導致果園銅（Cu）污染問題日益嚴重。相關研究表明，我國環渤海灣優勢蘋果產區因臨近工礦業，且存在嚴重的盲目施用化肥、農藥現象，導致土壤中Cu過量積累^［1］。單正軍等對江蘇徐州大沙園30處蘋果園及山東即墨12處蘋果園的銅含量進行測定，發現分別有6.7%和8.3%的土壤Cu含量遠超果園土壤Cu含量的二級標準^［2］。因此，果園土壤Cu污染已成為果樹生產中亟需解決的重要問題。

Cu是自然界中廣泛存在的重金屬元素，是植物體內的微量營養元素之一，參與光合電子傳遞作用、碳同化和氮代謝等多種生理反應^［3］。但土壤Cu含量超標會影響植物根系正常發育、抑制光合呼吸作用、減少葉片色素含量，進而導致植株生長受損^［4-5］。過量Cu還能導致活性氧（ROS）的產生，使細胞膜脂過氧化，從而破壞細胞膜結構與功能。為了緩解Cu脅迫引起的氧化損傷，植物會通過激活抗氧化防御系統來抵御毒害。其中游離脯氨酸、可溶性酚、抗壞血酸等抗氧化物質與超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等酶類物質，在ROS清除過程中發揮重要作用^［6-7］。目前，關于Cu脅迫對植物生長發育及生理特性的影響已在許多農作物如小麥、玉米、辣椒上開展^［8-10］，但Cu脅迫對蘋果影響的研究較少，其耐Cu脅迫閾值尚不明確。鑒于此，本研究以東北冷涼氣候區廣泛栽植的寒富蘋果幼苗為試材，通過設置不同濃度Cu處理，來探索Cu脅迫對蘋果幼苗生長發育及生理特性的影響。旨在為明確寒富幼苗的耐Cu閾值提供理論基礎，為農戶合理施用含Cu肥料及相關制劑提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

本試驗于沈陽農業大學果樹科研基地（123°341′E，41°491′N）進行。以一年生寒富蘋果（Malus domestica Borkh.）枝條為接穗，山定子（Malus baccata Borkh.）為砧木，于2018年4月采用芽接的方式進行嫁接。培養期間每天澆Hoagland營養液（Cu濃度為0.5 μmol/L）50 mL^［11］，以滿足試材的正常生長需要，待其長到15～20 cm時進行Cu處理。選取長勢一致的幼苗，移栽至20 cm×20 cm 的營養缽內進行沙培，每個營養缽裝有4 kg沙子［Cu濃度背景值為（1.03±0.2） mg/kg］。以Hoagland營養液中的基礎Cu濃度為對照（CK），額外添加不同濃度的CuSO₄溶液為處理，分別為T1，60 mg/kg；T2，180 mg/kg；T3，300 mg/kg；T4，600 mg/kg；T5，900 mg/kg。共計6個處理，每個處理設6次重復，培養60 d后收獲試材，用于指標測定。試材收獲前，用蒸餾水沖洗各株幼苗，除去根系表面的Cu²⁺及植株上的雜質。然后將各組織分別收取，記錄鮮質量。取好的樣品放入液氮中，于超低溫冰箱保存，以便進行后續試驗。

1.2 測定項目

1.2.1 生物量、根系構型 稱取100 mg左右的各組織鮮樣于60 ℃下烘干，測定其干質量、干濕比與生物量。將幼苗根洗凈后，利用WinRHIZO根系掃描系統（WinRHIZO 2012，Regent Instruments Canada INC.，Montreal，Canada）測定各個植株的根系構型。

1.2.2 光合參數及熒光參數的測定 在試材收獲之前對幼苗成熟葉（LPI=7～9）進行測定，利用CIRAS-2光合儀測定葉片的凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率及胞間CO₂濃度。利用Handy-PEA連續激發式熒光儀測定葉片的PSⅡ最大化學效率及光合性能指數。

1.2.3 Cu含量、總Cu量、富集系數及轉運系數的測定 稱取各組織鮮樣（根取0.5 g左右，莖和葉各取0.7 g左右）進行消煮（溫度100 ℃，穩定于 200 ℃），利用火焰原子吸收分光光度計（Hitachi 180-80，HitachiLtd，Tokyo，Japan）測定各組織Cu含量和總Cu量^［12］。根據各組分的Cu含量與土壤中Cu含量的比值，來計算富集系數（BCF）。用幼苗地上部分Cu含量與根系部分Cu含量的比值，計算樣品的轉運系數（T_f）。

1.2.4 O^-₂·、H₂O₂和MDA含量測定 超氧陰離子（O^-₂·）、過氧化氫（H₂O₂）的測定分別參照Zhou等^［13］、He等^［14］的方法。丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法，取上清液利用分光光度計測定待測溶液450、532、600 nm處的吸光度。

1.2.5 抗氧化物的測定 總硫醇（T-SH）含量的測定參照Zhou等的方法^［11］，可溶性酚、谷胱甘肽（TG）、還原型谷胱甘肽（GSH）及氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量的測定參照He等的方法^［12］。總抗壞血酸（TA）、抗壞血酸（ASC）和脫氫抗壞血酸（DHA）含量的測定分別使用抗壞血酸含量測定試劑盒（微板法）和脫氫抗壞血酸含量測定試劑盒（微板法）2種試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）測定。超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）、過氧化物酶（POD）及過氧化氫酶（CAT）的活性測量方法參照Wang等的方法^［15］。

1.3 數據分析

采用SPSS Statistics軟件對本試驗中所得的數據進行統計與分析。所有數據在統計與分析前會進行正態分布檢測。方差分析F檢驗當P<0.05時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 Cu脅迫對蘋果幼苗生長的影響

由圖1所示，當Cu濃度超過300 mg/kg，幼苗表現出明顯的Cu脅迫現象。表現為株高降低，根系整體褐色加深、主根變短、側根與白根數量減少，并且出現葉片變小且葉片邊緣發生卷曲現象。

由表1可知，當Cu脅迫濃度為60、180 mg/kg時，幼苗生物量和根構型相關參數與對照相比無顯著差異。但當Cu脅迫濃度超過300 mg/kg，植株生物量、根構型均有顯著降低趨勢，并且這種不利影響隨Cu脅迫濃度的增加而增大。最高濃度處理（T5）與對照相比，根質量、莖質量以及葉質量分別降低了40.23%、42.46%和33.29%；總根長、根總表面積和根總體積分別降低了31.26%、12.04%和33.53%，這與試材生長狀況表現一致。

由表2可知，蘋果幼苗的凈光合速率與氣孔導度在Cu處理濃度超過300 mg/kg后呈顯著下降趨勢，最高處理（T5）與對照相比，分別下降57.81%和65.12%。胞間CO₂濃度在Cu脅迫濃度為 180 mg/kg后逐漸下降。PSⅡ最大化學效率和光合性能指數在Cu濃度≥300 mg/kg后顯著下降。最高濃度下葉片的PSⅡ最大化學效率和光合性能指數與對照相比分別下降了13.01%和78.32%。

2.2 Cu脅迫對蘋果幼苗中Cu含量的影響

由圖2可知，蘋果幼苗各組織Cu含量為根＞砧木莖>葉＞莖，其中地下部（根）的Cu含量遠大于地上部。各組織的Cu含量隨著Cu處理濃度的增加而逐漸增大，當Cu處理濃度超過300 mg/kg后，根中的Cu含量大幅提高。

由圖3-a可知，根中總Cu量整體最多，其次是砧木莖，接穗莖、葉組織相對較少。各組織的總Cu量隨著Cu處理濃度的增加而逐漸增大，當Cu濃度高于300 mg/kg，根系中總Cu量急劇增加。BCF以180 mg/kg的Cu處理濃度為臨界點，表現出先降低后升高的趨勢（圖3-b）。無論在多少濃度的環境下，幼苗地上部分的T_f都是砧木莖＞葉＞莖，且隨著Cu濃度提高，砧木莖和葉的Tf呈下降趨勢（圖3-c）。

2.3 Cu脅迫對蘋果幼苗O^-₂·、H₂O₂和MDA含量的影響

如圖4所示，隨著Cu濃度提高，寒富蘋果幼苗根、莖和葉中O^-₂·含量逐漸增加，并在Cu脅迫濃度為900 mg/kg時達到最大值。與對照相比，各組織的H₂O₂含量在低濃度（60、180 mg/kg）Cu脅迫下有小幅增加，但當Cu濃度超過300 mg/kg時，其含量顯著增加（圖4-b）。MDA含量的變化趨勢與O^-₂·和H₂O₂含量類似（圖4-c）。

2.4 Cu脅迫對蘋果幼苗抗氧化系統的影響

由圖5可知，Cu脅迫誘導了幼苗各組織中游離脯氨酸的積累。當Cu濃度超過300 mg/kg，根和葉中游離脯氨酸的含量急劇增加（圖5-a1～圖5-a3）。最高濃度Cu處理與對照相比，根、莖、葉中游離脯氨酸的含量分別提高了77.94%、34.11%和71.57%。與對照相比，根中總硫醇含量隨著Cu濃度的提高顯著下降，其中根系下降幅度最大，最高濃度處理時較CK下降了43.29%，而莖則以 300 mg/kg 的Cu濃度為臨界點呈先上升后下降的趨勢（圖5-b1～圖5-b3）。由圖5-c1～圖5-c3可知，隨著Cu濃度提高，根系可溶性酚含量逐漸降低。莖中的可溶性酚含量以300 mg/kg Cu處理濃度為臨界點，表現出先上升后下降的趨勢。而各組織中GSH含量以300 mg/kg的Cu濃度為臨界點，呈先增多后減少的趨勢（圖5-d1～圖5-d3）。

由圖6可知，隨著Cu濃度提高，幼苗各組織中SOD活性變化各不相同，其中根和莖部分以 300 mg/kg 的Cu濃度為臨界點，隨Cu濃度提高，呈先上升后下降的變化趨勢。葉片部分則隨著Cu濃度的升高，SOD活性顯著下降，并且葉片中SOD活性明顯低于莖和根（圖6-a1～圖6-a3）中。與對照相比，除莖中T5濃度以外，根與莖中CAT活性均隨著Cu濃度提高而顯著降低，葉片部分則是以 300 mg/kg 的Cu濃度為臨界點表現出先升高后降低的趨勢（圖6-b1～圖6-b3）。對于APX活性而言，與對照相比，根系和葉片部分的APX活性均以300 mg/kg為臨界點表現出先升高后降低的趨勢，而莖中則逐漸下降，其中根系部分APX活性最高（圖6-c1～圖6-c3）。各組織中的POD活性變化與SOD活性變化趨勢一致，莖中POD活性最高，葉片中POD活性遠低于根、莖（圖6-d1～圖6-d3）。對于GR活性來說，與對照相比，當Cu濃度低于300 mg/kg時幼苗根系的GR活性顯著提高，高于這個濃度之后呈顯著降低的趨勢。而莖和葉部分的GR活性隨著Cu濃度的提高表現出下降趨勢（圖6-e1～圖6-e3）。

3 討論

Cu在植物生理代謝過程中發揮重要作用，一般認為植物組織中Cu含量以5～30 mg/kg為宜^［16-17］。當植物中的Cu濃度超過臨界限值時會對植物細胞產生毒性，抑制植物生長^［18-19］。黎建玲等發現當Cu濃度大于50 mg/L 時，南瓜種子萌發和幼苗根系的生長會被顯著抑制^［20］；韓承華等在五月慢油菜上發現當Cu濃度大于90 mg/L 時，試材根系發育受損，植株會有死亡現象發生^［21］。本研究表明，蘋果幼苗對Cu的耐受濃度為300 mg/kg，當Cu濃度過高，幼苗總根長、根總表面積和根總體積均顯著下降。這可能與高Cu濃度引起氣孔導度下降、CO₂供應受阻，致使凈光合速率降低、光合底物減少有關。對葉綠素熒光參數的分析可知，高濃度Cu處理下，葉片PSⅡ最大化學效率和PIabs均呈下降趨勢，進一步說明Cu脅迫會顯著抑制幼苗葉片的光合作用，影響根系生長，降低幼苗生物量。

植物通過將重金屬滯留在根中來減弱其毒害作用。本研究通過對各組織中Cu含量和總Cu量進行測定，表明蘋果幼苗可以將大部分的Cu滯留在根中，從而抑制Cu向地上部分轉運，生物富集系數也明確了這一現象，這與前人研究結果^［22］類似。在本試驗中，蘋果幼苗的Cu轉運系數以180 mg/kg為臨界點，呈先升高再降低的變化趨勢，這可能是因為當Cu濃度達到300 mg/kg時，其根系受損，導致向地上部分的轉運能力降低。

Cu脅迫會誘導ROS產生與MDA的積累，對植物造成氧化脅迫，從而對植物生長產生抑制，嚴重時甚至引起細胞死亡^［23］。這一現象在甘蔗、粉葛、菠菜等植物中已經被證實^［24-26］。雖然低濃度的ROS可作為信號分子參與調節植物生長發育和逆境脅迫響應^［27］，但當濃度高于細胞所能承受的限度時，會以極強的氧化性造成細胞膜脂過氧化，影響蛋白質、脂質甚至核酸的功能，最終導致細胞損傷乃至死亡^［28］。本試驗表明，隨著Cu濃度提高，幼苗各組織中O^-₂·與 H₂O₂含量均有增加趨勢。當Cu濃度超過300 mg/kg時，各組織中的MDA含量顯著增加，這可能是活性氧的積累促進MDA的產生，膜透性增加受損^［29］。進一步說明隨著Cu濃度增大，蘋果幼苗細胞膜受到的傷害越嚴重。由此可以判斷此時幼苗已經開始受到Cu脅迫傷害，且隨著細胞膜脂過氧化程度加深，幼苗生理代謝受到影響，最終表現為生長受到抑制。

為了免受ROS侵害，植物進化出一系列復雜的防御機制來避免或減少氧化損傷^［30-32］，游離脯氨酸為其中重要的物質之一。在植物組織中廣泛積累的游離脯氨酸一方面能協調原生質體內外的滲透平衡，提高植物的抗氧化能力^［33］；另一方面可與總硫醇、可溶性酚共同作為非酶類抗氧化劑參與活性氧清除。蔣英等研究指出，Cu脅迫條件下，絲瓜中游離脯氨酸含量呈顯著上升趨勢，且隨Cu 濃度的提高而提高^［34］。本研究同樣發現，當Cu濃度超過300 mg/kg，各組織中脯氨酸含量急劇上升，而總硫醇和可溶性酚含量并未隨著Cu濃度提高而逐漸增加，這可能說明總硫醇和可溶性酚不是蘋果幼苗抵抗Cu脅迫的關鍵ROS清除物質。

谷胱甘肽-抗壞血酸循環是保護植物細胞免受氧化脅迫的重要途徑^［35］。GSH的提高有助于清除活性氧。闞世紅等研究發現，外源硫酸鈉可以通過維持高水平的GSH來降低膜脂過氧化程度，緩解Cu脅迫對生菜幼苗生長的抑制^［36］。本試驗中，當Cu濃度低于300 mg/kg時，幼苗根中GSH的含量呈上升趨勢，這使GSH被積累，有利于清除由Cu脅迫導致的過量ROS。此外，植物體內的抗氧化酶系統也在遭受氧化脅迫時發揮關鍵作用。本研究表明，當蘋果幼苗受到Cu脅迫時，根中的SOD、APX、POD、GR，莖中SOD、POD以及葉中CAT、APX的活性均顯著升高。但當Cu濃度高于300 mg/kg，這些酶的活性均出現下降趨勢，這可能是由于此時的Cu濃度已超過了植物的調節能力范圍，導致酶活性降低^［37］，這與李曉梅等的研究結果^［38-39］一致。

綜上，本研究分析比較了不同供Cu水平下幼苗生長發育情況及對活性氧和抗氧化物的影響，表明300 mg/kg的Cu濃度是寒富幼苗能忍耐的最高限度，有助于探明蘋果對Cu脅迫的抵御機制，為明確寒富幼苗受Cu毒害的閾值提供理論基礎。

4 結論

供Cu量過高（超過300 mg/kg）會抑制蘋果幼苗的正常生長，降低葉片光合作用，抑制根系發育。過量的Cu主要在根系中積累。Cu脅迫會導致ROS與MDA過量積累，造成氧化脅迫。雖然蘋果幼苗可通過提高抗氧化物含量及抗氧化酶活性來抵御Cu毒害，但當Cu濃度超過300 mg/kg時抗氧化系統受到顯著抑制，這說明蘋果幼苗能忍耐的最高環境Cu濃度為300 mg/kg。

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