不同葉片病害癥狀桃Lhcb基因的克隆與表達(dá)分析

張子萌 楊麗娟 盧美光 李世訪

摘要：以我國健康山毛桃和不同癥狀的油桃葉片為試驗材料，基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，通過基因克隆獲得編碼捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的Lhcb基因全長序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期揭示不同桃品種Lhcb基因序列差異及其表達(dá)與功能，豐富Lhcb基因的序列信息，探究Lhcb基因表達(dá)與不同葉片病害癥狀間的關(guān)系?？寺～@得山毛桃、無癥狀及花葉癥狀油桃的Lhcb基因全長序列，分別命名為Lhcb-Pd1、Lhcb-Ppn1和Lhcb-Ppn3，全長均為1 925 bp，與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上登錄的桃Lhcb-Pp1基因（1 912 bp）相比，在1 593 nt處多出10個堿基。全長包括1個804 bp（編碼267個氨基酸）的開放閱讀框、CAAT-signal和TATA box等作用元件。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，獲得的3個目的基因序列與李屬植物的基因序列聚為1組。蛋白質(zhì)分析結(jié)果表明，桃Lhcb蛋白的相對分子量為 28 332.17 u，理論等電點為5.30，是親水性蛋白；其二級結(jié)構(gòu)主要由53% α-螺旋、33%無規(guī)卷曲和24%跨膜螺旋組成，無β-折疊結(jié)構(gòu)。對無癥狀及花葉癥狀油桃樣品中Lhcb基因表達(dá)差異進(jìn)行分析，通過半定量RT-PCR和RT-qPCR，結(jié)果表明，與無癥狀樣品相比，花葉油桃中Lhcb轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄水平較低，Lhcb基因的相對表達(dá)量顯著下調(diào)。

關(guān)鍵詞：桃；Lhcb基因；基因克隆；基因表達(dá)；蛋白分析

中圖分類號：S436.621.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-S662.11302（2023）11-0035-08

收稿日期：2022-11-01

基金項目：國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-30-3-01）。

作者簡介：張子萌（1998—），女，河北保定人，碩士研究生，主要從事果樹病毒學(xué)研究。E-mail：zimeng980809@163.com。

通信作者：盧美光，博士，研究員，主要從事果樹病毒學(xué)研究。E-mail：mglu@ippcaas.cn。

桃樹是我國非常重要的落葉核果類果樹，屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus），在世界范圍內(nèi)被普遍引種、栽培。山毛桃（Prunus davidiana Franch）耐寒、耐旱且具有發(fā)達(dá)的根系，是黃土丘陵和北方實質(zhì)山區(qū)自然分布的樹種。油桃（Prunus persica cv. nectarina）是桃的變種，由于其采摘食用便利，商品性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)效益高^［1］，故其在桃產(chǎn)業(yè)中所占比重逐年增大。與薔薇科其余木本植物（如李、櫻桃）相比，桃的基因組較?。?30 Mbp），且童期僅為2～3年，因此桃可作為薔薇科植物研究中的模式基因組物種^［2］。

捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白在高等植物的光合作用中發(fā)揮著重要功能，其與光合反應(yīng)體系中的有機(jī)色素分子連接形成復(fù)合體，將光能信號迅速傳遞到光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）、光系統(tǒng)Ⅱ（PS Ⅱ）的反應(yīng)中心，推動光合反應(yīng)的進(jìn)行^［3］。捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白復(fù)合體在PSⅠ和PSⅡ中均存在，PS Ⅱ-LHCⅡ［the light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins （LHC Ⅱ） associated with photosystem Ⅱ （PS Ⅱ）］主要包括1個三聚體和3個單體蛋白，三聚體分別由Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3基因編碼，3個單體蛋白則分別由 Lhcb4（CP29）、Lhcb5（CP24）和Lhcb6（CP26）基因編碼^［4］。目前，已有許多植物的Lhcb基因被克隆，如豌豆^［5］、矮牽牛^［6］、擬南芥^［7］、番茄^［8］、小麥^［9］、花椰菜^［10］、毛竹^［11］、長白松^［12］等。據(jù)報道，捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白也參與了植物抗逆、環(huán)境適應(yīng)性等方面的調(diào)節(jié)。例如，Zhang等在研究2種生態(tài)型東南景天Lhcb2基因在鎘、鋅脅迫下的表達(dá)變化時發(fā)現(xiàn)，鎘、鋅脅迫處理能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草中該基因的表達(dá)量^［13］。Petit等對殺菌劑脅迫后葡萄光合作用相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)光合作用的降低伴隨著PS Ⅱ的psbP1（PsbP subunit of photosystem Ⅱ）基因、PSⅠ的cab基因［chlorophyll a/b-binding （Cab） proteins］的抑制表達(dá)，使得光合作用受到影響，但沒有觸發(fā)任何植物防御反應(yīng)^［14］。

本研究基于大田溫室中具有不同病害癥狀的油桃葉片（無癥狀和花葉）樣品的sRNA和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選獲得桃中與光合作用密切相關(guān)的Lhcb基因。雖然目前在NCBI中已登錄1條桃（Prunus persica cv. Stark Earlilo）Lhcb基因（Lhcb-Pp1）全序列，但是未見對其相關(guān)序列和功能研究的報道。因此，本研究以Lhcb-Pp1基因為模板，分別設(shè)計5′、3′端和特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增我國山毛桃與油桃中不同表型葉片的Lhcb基因序列；利用BioEdit、MEGA 7.0、Phyre2、SWISS MODEL及ExPASy-ProtParam等軟件/在線工具對獲得的基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用半定量RT-PCR、RT-qPCR技術(shù)檢測具有不同病害癥狀的油桃樣品中Lhcb基因的表達(dá)量差異。研究結(jié)果能解析不同桃品種相關(guān)Lhcb基因的序列差異及油桃Lhcb基因與花葉癥狀的相關(guān)性，從而為植物病害防治研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山毛桃種子于2021年3月份購自浙江杭州，于4 ℃黑暗冷藏至少2個月后進(jìn)行消毒、去殼、播種得到實生苗；油桃葉片樣品（S01、S03）品種來源為中油4號，于2017年5月采自管理與栽培條件一致的遼寧省大連市大田溫室，其中S01為無癥狀，S03為花葉。采集的新鮮葉片經(jīng)液氮處理后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?，后續(xù)試驗于2021年12月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所進(jìn)行。

1.2 試驗方法

1.2.1 編碼捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白Lhcb基因的克隆與測序 植物總RNA的提取和引物設(shè)計：使用多糖、多酚植物總RNA提取試劑盒提取植物總RNA，并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank中已登錄的桃Lhcb-Pp1基因序列（登錄號L36064.1）設(shè)計引物（表1），對Lhcb基因進(jìn)行全長擴(kuò)增。5′、3′端全長擴(kuò)增引物（Full-F/R）預(yù)期擴(kuò)增出大小為 1 912 nt 左右的目的基因全序列及5′或3′端部分片段。另設(shè)計3′端序列擴(kuò)增引物（5′-991F），預(yù)期目的片段擴(kuò)增大小為900 nt左右。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成，詳見表1。

RT-PCR擴(kuò)增：以植物總RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；用Q5 High-Fidelity 2X Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

目的基因片段的克隆和測序：PCR目的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化。將純化產(chǎn)物連接至pTOPO-Blunt克隆載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR檢測鑒定后，挑選陽性克隆送至北京擎科生物科技有限公司測序。用BioEdit^［15］軟件對克隆測序得到的序列進(jìn)行拼接，獲得Lhcb基因全長序列。

1.2.2 序列分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載已登錄的桃Lhcb-Pp1基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列（登錄號：AAA50310.1），用BioEdit軟件對“1.2.1”節(jié)擴(kuò)增到的基因序列進(jìn)行比對，分析其序列的差異。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 為了確定所得Lhcb基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系，除供試樣品Lhcb基因外，從NCBI上下載桃、杏、梅、甜櫻桃、月季、白梨、蘋果、野草莓、蓖麻、大麻、大豆、野大豆、美花煙草、擬南芥、雷公藤、胡楊、茶、油茶、銀白楊、蓮、向日葵、核桃、山核桃、木薯、橄欖、葡萄的Lhcb基因及其編碼的蛋白序列，在BioEdit中進(jìn)行序列比對，用MEGA 7.0^［16］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建選擇General Time Reversible model和Gamma Distributed（G）模式運(yùn)行程序，采用最大似然法（maximum likelihood，ML），Bootstrap值設(shè)為1 000次。

1.2.4 Lhcb蛋白的理化性質(zhì)分析 為了明確不同植物L(fēng)hcb蛋白之間的親緣關(guān)系是否和其理化性質(zhì)相關(guān)，用ExPASy-ProtParam^［17］（https：//www.expasy.org/resources/protparam）對桃和其他物種的Lhcb蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析。

1.2.5 Lhcb蛋白二級結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測 利用Phyre2在線工具^［18］（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）對桃中的Lhcb蛋白進(jìn)行分析。先輸入蛋白序列，再預(yù)測Lhcb蛋白的二級結(jié)構(gòu)，并以Pea Light-Harvesting Complex（PDB ID：2bhw）為模型，用Swiss Model在線工具（https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行同源建模，用Swiss-PDB Viewer軟件查閱其三維結(jié)構(gòu)^［19］。

1.2.6 半定量RT-PCR及RT-qPCR技術(shù) 將油桃樣品的RNA定量2 μg后再反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋20倍后可用作模板。以TEF2（translation enlongation factor 2，翻譯延伸因子2）^［20］為內(nèi)參基因，以桃轉(zhuǎn)錄本PRUPE_ppa0100 15 mg基因序列設(shè)計特異引物。半定量RT-PCR：將得到的cDNA分別按1 ∶2、1 ∶20、1 ∶200的比例稀釋，PCR反應(yīng)使用2×Taq PCR MasterMix試劑盒進(jìn)行。引物 Lhcb-F：5′-AACCGCATCCAAGTCCA-3′，Lhcb-R：5′-CTCAAGTTCTCAGGCTCAC-3′。RT-qPCR：用含有 SYBR GreenⅠ的 TransStart Green qPCR SuperMix試劑盒配制反應(yīng)體系，在MyGo Pro Real-Time PCR System （IT-IS Life Science Ltd.，UK）上進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。引物qLhcb-F：5′-CTCTTACCTCACTGGAGAATT-3′，qLhcb-R：5′-ATACAGCCTCACCGAACT-3′，每個qPCR反應(yīng)設(shè)1個陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 編碼捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白Lhcb基因的克隆與序列分析

利用5′、3′端全長擴(kuò)增引物Full-F/R，通過 RT-PCR 擴(kuò)增、克隆測序得到山毛桃全序列與油桃S01 5′端1 047 bp、3′端1 400 bp的片段及S03 5′端1 047 bp的部分序列。通過3′端擴(kuò)增引物5′-991F、3′-Full-R擴(kuò)增，獲得S03 3′端889 bp的片段。最終通過克隆、序列拼接與測序，獲得S01、S03的完整序列。山毛桃、油桃S01、S03的Lhcb基因分別命名為Lhcb-Pd1、Lhcb-Ppn1、Lhcb-Ppn3（圖1）。

序列分析結(jié)果表明，Lhcb-Pd1、Lhcb-Ppn1和Lhcb-Ppn3基因全長1 925 bp，包括1個804 bp的開放閱讀框（ORF），可編碼267個氨基酸，預(yù)測其編碼PSⅡ-LHC Ⅱ，Type1，非編碼區(qū)中包含 CAAT-signal、TATA box等作用元件。與 Lhcb-Pp1序列（基因全長1 912 bp）相比，明顯的差異是克隆的3個目的基因序列在1 593 nt處均有10 bp堿基（CAGTCTGCAG）的插入（圖2），在266 nt處有G插入，在1 278、1 303 nt處有A插入（圖2）。但是與Lhcb-Pp1基因編碼區(qū)（位置：337～1 140 nt）的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，其編碼的氨基酸高度保守，相似性為100%。此外，將得到的目的基因在NCBI中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)100余種植物的Lhcb基因中，只在杏（登錄號：AP019299.1）中發(fā)現(xiàn)相同的10 bp堿基插入（圖中未顯示），其他物種并未發(fā)現(xiàn)相同堿基插入。

2.2 Lhcb基因及其編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將Lhcb-Pd1、Lhcb-Ppn1和Lhcb-Ppn3全長基因與模式植物擬南芥的Lhcb1全長基因進(jìn)行序列比對，結(jié)果表明，3條目的基因核苷酸全序列與擬南芥Lhcb1的5條基因序列的一致性都較低，為34.6%～39.8%，但其編碼區(qū)的蛋白編碼核苷酸序列的一致性較高，為67.4%～67.9%，氨基酸序列一致性為87.8%～88.1%；李屬代表植物如甜櫻桃、梅、杏等與桃目的基因編碼蛋白編碼氨基酸序列的一致性為96.3%～98.6%，不同桃品種之間的Lhcb基因同源性較高，其所編碼的蛋白編碼氨基酸序列一致性可達(dá)100%。上述結(jié)果表明，雖然不同物種相應(yīng)的Lhcb基因親緣關(guān)系不同，但是其編碼的蛋白質(zhì)在進(jìn)化上還是相對保守的。

對不同物種Lhcb基因編碼核苷酸序列和編碼蛋白的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，從桃中克隆到的3條基因與大多數(shù)李屬植物的基因聚在一起，親緣關(guān)系最近；與擬南芥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與序列比對結(jié)果一致；對不同桃品種而言，山毛桃、桃和油桃單獨聚在李屬植物遺傳組的1個亞組上（圖3）。

2.3 不同物種Lhcb蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

不同物種Lhcb蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，毛桃與油桃Lhcb蛋白的理化性質(zhì)一致。由表2可知，除月季、向日葵外，其余物種Lhcb蛋白的氨基酸殘基數(shù)為261～269個，相對分子量為27 700.74～28 633.67 u，理論等電點為5.10～6.33，大多數(shù)為親水性蛋白；不同植物的Lhcb蛋白理化性質(zhì)較一致，但也有差異，如擬南芥Lhcb1中的5個蛋白大都為疏水蛋白，可能是由氨基酸非保守域序列的差別造成的。

2.4 桃Lhcb蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)分析

用Phyre2對桃Lhcb蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，Lhcb主要由53% α-螺旋、33%無規(guī)卷曲和24%跨膜螺旋組成，無β-折疊結(jié)構(gòu)，預(yù)測結(jié)果的可信度為100%。以Pea Light-Harvesting Complex（LHC；PDB ID：2bhw）為模型，用Swiss-Model進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的同源建模，結(jié)果表明，桃Lhcb與Pea LHC的氨基酸序列相似性為94%，二者具有相似的三維結(jié)構(gòu)。桃Lhcb蛋白的空間結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，其主要由3條鏈組成，包括α-螺旋、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)（圖4）。與模式植物擬南芥相比，桃Lhcb蛋白的整體三維結(jié)構(gòu)與擬南芥S-LHCⅡ、M-LHCⅡ的三維結(jié)構(gòu)均相似，這些結(jié)構(gòu)也是捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的典型空間結(jié)構(gòu)，是其行使生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，也表明LHCⅡ蛋白在進(jìn)化上相當(dāng)保守。

2.5 半定量RT-PCR、RT-qPCR對油桃中Lhcb基因表達(dá)量的分析

圖5-A的半定量RT-PCR結(jié)果表明，隨著模板量的逐漸減少，S01、S03中內(nèi)參基因的量均無顯著差異，但S03中Lhcb基因的量表現(xiàn)為降低趨勢，當(dāng)cDNA含量稀釋200倍時，S01樣品中仍能見較亮的Lhcb擴(kuò)增條帶，而S03樣品中已基本看不見擴(kuò)增條帶。圖5-B的RT-qPCR結(jié)果也表明，S03花葉樣品中的Lhcb基因表達(dá)量明顯下調(diào)，S01樣品中的Lhcb基因表達(dá)量是S03的40倍左右（圖5-B）。以TEF2為內(nèi)參基因，通過半定量RT-PCR、RT-qPCR檢測油桃無癥狀（圖5-C）和花葉葉片（圖5-D的Lhcb基因表達(dá)量差異，獲得一致結(jié)果。由試驗結(jié)果可以推測，S03樣品中花葉癥狀的出現(xiàn)與Lhcb基因表達(dá)量的下調(diào)密切相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

在光合作用和植物抗逆的過程中，捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白都發(fā)揮著重要作用。本研究以我國山毛桃、油桃為供試樣品進(jìn)行Lhcb的全基因克隆，獲得了不同桃品種和不同癥狀樣品的Lhcb全基因序列，預(yù)測其編碼PS Ⅱ-LHCⅡ，Type1。序列分析結(jié)果表明，與NCBI中提交的桃品種Stark Earlilo的Lhcb基因相比，獲得的3條Lhcb全基因的序列均在1 593 nt非編碼區(qū)多出了10 bp堿基的插入，說明我國不同桃品種的Lhcb基因序列與NCBI中提交的桃品種存在差異，但獲得的目的基因編碼的Lhcb蛋白是高度保守的。經(jīng)過對NCBI中不同物種的Lhcb基因序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)只在杏中可以比對到插入的這10個堿基，而有研究發(fā)現(xiàn)，早在1992年，馬鋒旺等就已進(jìn)行桃與杏的雜交試驗，發(fā)現(xiàn)多數(shù)雜交組合有一定的親和性^［21］。在我國目前的果園中，果樹混種的現(xiàn)象十分普遍，難以避免桃杏之間的雜交，筆者推測，本研究中目的基因組DNA多出10個堿基可能與品種起源有關(guān)。

在模式植物擬南芥中，Lhcb1基因編碼PSⅡ-LHC Ⅱ（Type1蛋白），包含5條Lhcb1亞型基因（lhcb1.1、lhcb1.2、lhcb1.3、lhcb1.4、lhcb1.5）^［4］。對本研究獲得的目的基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，李屬植物的Lhcb蛋白大多為親水蛋白，而擬南芥Lhcb1中的5個蛋白大多為疏水蛋白。由于擬南芥Lhcb1基因編碼的蛋白質(zhì)中含有1段高度疏水序列即“通用LHC基序”（ELINGRLAMLGFLGFLVPELIT），而此序列并未在李屬植物中比對到，因此推測李屬植物和擬南芥Lhcb1蛋白的疏水性可能由氨基酸非保守域序列的差別造成^［22］。在擬南芥中，LHCⅡ蛋白中的幾個三聚體組件可以在特定位置同時與PSⅡ核心復(fù)合體結(jié)合，根據(jù)它們與PSⅡ二聚體核心（C2）的相對位置及與PSⅡ-LHCⅡ相互作用的強(qiáng)度，創(chuàng)造了4個不同的LHCⅡ類別：強(qiáng)（S）、中（M）、松散（L）和裸露（N），其中較為常見的是S-LHCⅡ、M-LHCⅡ，S-LHCⅡ是lhcb1.3的產(chǎn)物，M-LHCⅡ為lhcb1.4的產(chǎn)物^［22-23］，而桃Lhcb蛋白整體的三維結(jié)構(gòu)與S-LHCⅡ、M-LHCⅡ的三維結(jié)構(gòu)相似，這是捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的典型空間結(jié)構(gòu)，表明LHCⅡ蛋白在進(jìn)化上比較保守。

在田間條件下，桃花葉癥狀普遍發(fā)生，通常由缺素或病毒侵染引發(fā)。有研究表明，Lhcb基因普遍參與光能的捕獲與傳遞、葉片發(fā)育及各種脅迫應(yīng)答，如干旱脅迫、鹽脅迫、激素信號及病原脅迫^［24-25］。筆者用半定量RT-PCR、RT-qPCR技術(shù)對不同表型油桃樣品進(jìn)行Lhcb基因表達(dá)的差異分析，結(jié)果表明，花葉癥狀的油桃樣品PSⅡ-LHCⅡ，1型Lhcb基因的表達(dá)量顯著下調(diào)。筆者通過對無癥狀及花葉油桃樣品進(jìn)行病毒檢測，均檢測到桃潛隱花葉類病毒（PLMVd）^［26］，這是一種由335～351 nt 組成的環(huán)狀RNA分子^［27］，用不同的PLMVd序列分離物侵染桃樹后會有不同表型，被侵染的植株一般表現(xiàn)為不同癥狀的花葉、白化、延遲發(fā)芽等，有些表現(xiàn)為無癥狀的潛隱性侵染^［28］。筆者也發(fā)現(xiàn)了由PLMVd侵染引發(fā)的花葉癥狀的報道^［29］，與本研究樣品的花葉表型一致。此外，在本研究中，油桃無癥狀及花葉葉片樣品采集于相同管理條件和栽培環(huán)境的田間溫室，由此可以初步推測，花葉癥狀的產(chǎn)生可能與PLMVd侵染導(dǎo)致PSⅡ-LHCⅡ 1型Lhcb基因表達(dá)量下調(diào)有關(guān)，進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中。Lhcb蛋白為光合作用中的重要功能蛋白，其生理功能復(fù)雜，占光合膜中近50%的色素和約1/3的蛋白質(zhì)。Lhcb在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，因此對其研究也逐漸增多^［30］。LHC蛋白作為自然界最豐富的膜蛋白之一，目前關(guān)于Lhc基因的測序分析在一些模式植物中已較完善，在毛竹、金銀花、橡膠樹、景天、李屬植物等物種中，有少數(shù)LHC蛋白相關(guān)的基因被克隆測序，但對桃Lhcb基因的研究未見報道。此外，已有報道顯示，植物L(fēng)hcb基因的表達(dá)與非生物協(xié)迫有關(guān)，但對其與植物病原侵染的關(guān)系研究較少。因此，本研究對桃不同品種和不同病害癥狀的Lhcb基因的克隆與表達(dá)分析不僅有助于豐富Lhcb基因的序列信息，而且可為木本李屬植物栽培及病害防治等提供重要的參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］王志強(qiáng)，宗學(xué)普，劉淑娥，等. 我國油桃生產(chǎn)發(fā)展現(xiàn)狀及其對策［J］. 柑桔與亞熱帶果樹信息，2001，17（3）：3-5.

［2］霍如雪，劉振寧，楊 青，等. 桃PG基因家族的鑒定與分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（6）：33-40.

［3］Raghvendra A S. Photosynthesis：a comprehensive treatise［M］. Cambridge：Cambridge University Press，1998：644-653.

［4］Jansson S. A guide to the Lhc genes and their relatives in Arabidopsis［J］. Trends Plant Science，1999，4（6）：236-240.

［5］Coruzzi G，Broglie R，Cashmore A R，et al. Nucleotide sequences of two pea cDNA clones encoding the small subunit of ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase and the major chlorophyll a/b binding thylakoid polypeptide［J］. Journal of Biology Chemistry，1983，258（3）：1399-1402.

［6］Dunsmuir P，Smith S M，Bedbrook J. The major chlorophyll a/b binding protein of petunia is composed of several polypeptides encoded by a number of distinct nuclear genes［J］. Journal of Molecular and Applied Genetics，1983，2（3）：285-300.

［7］Leutwiler L S，Meyerowitz E M，Tobin E M. Structure and expression of three light-harvesting chlorophyll a/b binding protein genes in Arabidopsis thaliana［J］. Nucleic Acids Research，1986，14（10）：4051-4064.

［8］Pichersky E，Bernatzky R，Tanksley S D，et al. Molecular characterization and genetic mapping of clusters of genes coding chlorophyll a/b binding proteins in Lycopersicon esculentum （tomato）［J］. Gene，1985，40（2/3）：247-258.

［9］Lamppa G，Nagy F，Chua N H. Light regulated and organ specific expression of a wheat Cab gene in transgenic tobacco［J］. Nature，1985，316（6030）：750-752.

［10］Damarajua S，Schledeb S，Eckhardta U，et al. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants［J］. Journal of Plant Physiology，2011，168（12）：1444-1451.

［11］高志民，劉 成，劉穎麗，等. 毛竹捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因cab-PhE1的克隆與表達(dá)分析［J］. 林業(yè)科學(xué)，2009，45（3）：145-149.

［12］Jansson S，Gustafsson P. Type and type-genes for chlorophyll a/b binding proteins in the gymnosperm Pinus sylvestris （Scots pine）：cDNA cloning and sequence analysis［J］. Plant Molecular Biology，1990，14（3）：287-296.

［13］Zhang M，Senoura T，Yang X E，et al. Lhcb2 gene expression analysis in two ecotypes of Sedum alfredii subjected to Zn/Cd treatments with functional analysis of SaLhcb2 isolated from a Zn/Cd hyperaccumulator［J］. Biotechnology Letters，2011，33（9）：1865-1871.

［14］Petit A N，Wojnarowiez G，Panon M L，et al. Botryticides affect grapevine leaf photosynthesis without inducing defense mechanisms［J］. Planta，2009，229（3）：497-506.

［15］Gupta S K，Padmanabhan B R，Diene S M，et al. ARG-ANNOT，a new bioinformatic tool to discover antibiotic resistance genes in bacterial genomes［J］. Antimicrob Agents Chemother，2014，58（1）：212-220.

［16］Kumar S，Stecher G，Tamura K. MEGA7：molecular evolutionary genetics analysis Version 7.0 for bigger datasets［J］. Molecular Biology and Evolution，2016，33（7）：1870-1874.

［17］Duvaud S，Gabella C，Lisacek F，et al. Expasy，the Swiss Bioinformatics Resource Portal，as designed by its users［J］. Nucleic Acids Research，2021，49（W1）：W216-W227.

［18］Kelley L A，Mezulis S，Yates C M，et al. The Phyre2 web portal for protein modeling，prediction and analysis［J］. Nature Protocols，2015，10（6）：845-858.

［19］劉子楠，黎河山，宋梟禹. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測綜述［J］. 中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志，2020，37（9）：1203-1207.

［20］Tong Z G，Gao Z H，Wang F，et al. Selection of reliable reference genes for gene expression studies in peach using real-time PCR［J］. BMC Molecular Biology，2009（10）：71-85.

［21］馬鋒旺，康俊生. 桃和杏雜交親和性試驗［J］. 果樹科學(xué)，1996，13（4）：251-252.

［22］Kühlbrandt W，Wang D N，F(xiàn)ujiyoshi Y. Atomic model of plant light-harvesting complex by electron crystallography［J］. Nature，1994，367（6464）：614-621.

［23］Graca A T，Hall M，Persson K，et al. High-resolution model of Arabidopsis Photosystem Ⅱ reveals the structural consequences of digitonin-extraction［J］. Scientific Report，2021，11（1）：15534-15545.

［24］Staneloni R T，Rodriguez Batiller M J，Casal J J. Abscisic acid，high-light，and oxidative stress down-regulate a photosynthetic gene via a promoter motif not involved in phytochrome-mediated transcriptional regulation［J］. Molecular Plant，2008，1（1）：75-83.

［25］Xia Y S，Ning Z X，Bai G H，et al. Allelic variations of a light harvesting chlorophyⅡ A/B binding protein gene （Lhcb1） associated with agronomic traits in barley［J］. PLoS One，2012，7（5）：e37573-e37583.

［26］Xu Y X，Li S F，Na C Y，et al. Analyses of virus/viroid communities in nectarine trees by next-generation sequencing and insight into viral synergisms implication in host disease symptoms［J］. Scientific Report，2019，9（1）：12261-12273.

［27］Lee H J，Cho I S，Ju H J，et al. Development of a reverse transcription droplet digital PCR assay for sensitive detection of peach latent mosaic viroid［J］. Molecular and Cellular Probes，2021，58：101746-101753.

［28］Hadidi A，Giunchedi L，Shamloul A M，et al. Occurrence of peach latent mosaic viroid in stone fruits and its transmission with contaminated blades［J］. Plant Disease，1997，81（2）：154-158.

［29］Hammann C，Steger G. Viroid-specific small RNA in plant disease［J］. RNA Biology，2012，9（6）：809-819.

［30］孫欽秒，冷 靜，李良璧，等. 高等植物光系統(tǒng)Ⅱ捕光色素蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)與功能研究的新進(jìn)展 ［J］. 植物學(xué)通報，2000，17（4）：289-301.