含硅藻土負(fù)載香芹酚復(fù)合體的明膠基緩釋抗菌膜的制備與性能

李 森，馬 靈，李 婷，彭 爐，李莎莎，李慶業(yè)，周 曼，吳賀君

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川 雅安 625014）

明膠（gelatin，G）是一種由廢棄動(dòng)物骨頭、皮膚和結(jié)締組織中的膠原蛋白水解產(chǎn)生的高分子蛋白質(zhì)[1]，因其良好的成膜性、氣體阻隔性、耐油性以及資源豐富、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，成為塑料包裝的一種潛在替代品[2-3]。明膠膜的易吸水性導(dǎo)致其易受到細(xì)菌和霉菌的污染，且生物活性低，因此應(yīng)用受到限制[4]。香芹酚（carvacrol，C）是一種揮發(fā)性單萜酚，天然存在于牛至、百里香、冬季香薄荷等唇形科植物中，具有非特異性的抗氧化、抗細(xì)菌、真菌等功效[5-6]，Kavoosi等[7]將香芹酚添加至明膠膜后得到的復(fù)合膜表現(xiàn)出優(yōu)異的功能活性，可用于制備廣譜高效的抗菌活性食品包裝材料。然而，香芹酚的快速揮發(fā)致使其存在抑菌時(shí)效短、利用率低的問(wèn)題[8]。

為了抑制香芹酚活性成分的揮發(fā)，目前有研究將其封裝于埃洛石納米管等無(wú)機(jī)礦物制備抗菌復(fù)合體中，提升其長(zhǎng)效抗菌效果[9-11]。然而埃洛石納米管對(duì)于細(xì)胞的潛在毒性可能會(huì)限制其在食品包裝中進(jìn)一步應(yīng)用[12-13]。硅藻土（diatomite，D）是硅藻遺骸經(jīng)地質(zhì)作用形成的硅質(zhì)多孔沉積巖，其具有無(wú)毒、孔隙率高（高達(dá)80%，孔徑50～200 nm）、比表面積大、吸附性強(qiáng)以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。已有研究人員用硅藻土負(fù)載牛至精油[16]、百里酚[17]等制備包封效果好并具有緩釋特性的新型抗菌復(fù)合體。然而目前將這種硅藻土負(fù)載植物精油的新型抗菌復(fù)合體用于制備緩釋活性包裝膜的研究還相對(duì)較少。基于此，本研究將硅藻土/香芹酚（D/C）復(fù)合體與明膠復(fù)合，探究D/C復(fù)合體添加量對(duì)明膠膜結(jié)構(gòu)與性能的影響并驗(yàn)證其緩釋效果，為促進(jìn)含香芹酚等植物精油的明膠基抗菌復(fù)合膜的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明膠（化學(xué)純）、硅藻土（純度99%、堆積密度0.47 g/cm3）、乙醇（分析純）（化學(xué)純） 成都科隆化學(xué)品有限公司；香芹酚（分析純） 上海瑞永生物科技有限公司；丙三醇（分析純） 成都金山化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 南京都萊生物技術(shù)有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂 杭州微生物試劑有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）（ATCC29215）、大腸桿菌（Escherichia coli）（ATCC25922） 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2A型恒溫磁力攪拌器 天津賽德利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；SHZ-DIII型循環(huán)水式真空泵 北京市永光明醫(yī)療器械有限公司；SU-1510型掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀、Varioskan Flash型全波長(zhǎng)多功能熒光酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Rise-2006型激光粒度分析儀 濟(jì)南潤(rùn)之科技有限公司；CM2300D型色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)投資有限公司；WGW型光電霧度儀 上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；HD-A821-1型電子拉力試驗(yàn)機(jī)東莞市海達(dá)儀器有限公司；DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 D/C復(fù)合體的制備

D/C復(fù)合體的制備參考文獻(xiàn)[18]的方法并稍作修改。取一定質(zhì)量（m1/g）硅藻土混合足夠量的香芹酚，加入到抽濾瓶中，磁力攪拌10 min。再通過(guò)真空抽濾增大瓶?jī)?nèi)內(nèi)部壓力，將硅藻土表面香芹酚壓入硅藻土的孔洞中，同時(shí)排出硅藻土孔洞中的空氣。以上抽濾操作重復(fù)6 次，每次40 s。抽濾結(jié)束后，將混合物加入至已稱質(zhì)量的離心管（m2/g）中，4 000 r/min離心10 min，回收離心游離香芹酚（上清液）于抽濾瓶中，重復(fù)上次操作，進(jìn)行二次離心。再次稱量含有混合物的離心管總質(zhì)量（m3/g）。將離心出來(lái)的游離部分香芹酚回收至廣口瓶，可重復(fù)利用。硅藻土和香芹酚在D/C復(fù)合體中的相對(duì)含量分別按公式（1）、（2）計(jì)算。

1.3.2 D/C復(fù)合體的表征

1.3.2.1 外觀觀察

使用數(shù)碼相機(jī)拍攝硅藻土負(fù)載香芹酚前后的照片，觀察它們的顏色變化。

1.3.2.2 掃描電子顯微鏡觀察

將硅藻土和經(jīng)過(guò)40 ℃干燥12 h后的D/C復(fù)合體用導(dǎo)電樹脂固定在青銅樁上，在離子濺射鍍膜機(jī)上濺射金2 min，再利用SU-1510型掃描電子顯微鏡在20 kV下進(jìn)行拍照觀察。

1.3.2.3 紅外光譜測(cè)定

采用溴化鉀壓片法，利用Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)香芹酚、硅藻土和D/C復(fù)合體進(jìn)行分析。分辨率為4 cm－1，測(cè)量記錄的波數(shù)范圍為650～4 000 cm－1，平均掃描32 次。

1.3.2.4 粒徑測(cè)定

采用Rise-2006激光粒度分析儀測(cè)定硅藻土負(fù)載香芹酚前后的粒徑。

1.3.3 明膠基抗菌復(fù)合膜的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法制備明膠基復(fù)合膜，具體步驟如下：首先稱取10 g明膠與2.5 g甘油，添加100 mL蒸餾水，在60 ℃恒溫水浴中磁力攪拌50 min后形成膜液；繼續(xù)冷卻攪拌降溫至40 ℃后，向膜液加入一定量D/C復(fù)合體，持續(xù)攪拌10 min，用膠頭滴管吸出多余氣泡；將膜液倒入自制230 mm×230 mm塑料成膜板，流延均勻后置于常溫環(huán)境（25 ℃）下進(jìn)行自然風(fēng)干，1 d后揭膜；將薄膜置于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（55±5）% 的恒溫恒濕箱中平衡24 h得到成品。

在制備含D/C復(fù)合體的復(fù)合膜時(shí)，復(fù)合體添加量分別為膠干質(zhì)量的0%、10%、20%、30%，分別記作空白組G-K、G-D/C1、G-D/C2、G-D/C3。在明膠膜中分別單獨(dú)添加與G-D/C3組等添加量的香芹酚和硅藻土制備復(fù)合膜作為對(duì)照，記作G-C和G-D。

1.3.4 明膠基抗菌復(fù)合膜的表征

1.3.4.1 掃描電子顯微鏡觀察

采用SU-1510型掃描電子顯微鏡觀察G-K、G-C、G-D/C3薄膜樣品截面以及表面的微觀形貌，加速電壓15 kV。

1.3.4.2 紅外光譜測(cè)定

從各組分薄膜上剪取一小塊樣品，利用Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀在ATR模式下直接測(cè)定，掃描范圍650～4 000 cm－1、分辨率2.0 cm－1、累加32 次。

1.3.4.3 厚度測(cè)定

根據(jù)GB/T 6672—2001《塑料薄膜和薄片厚度測(cè)定 機(jī)械測(cè)量法》，用螺旋測(cè)微器在被測(cè)膜上隨機(jī)取點(diǎn)，測(cè)量5 次取平均值，以μm為單位。

1.3.4.4 色澤測(cè)定

薄膜顏色由CM2300D型色差儀測(cè)定薄膜的顏色指數(shù)（L、a、b）。L值代表亮度；a值代表紅綠色度，正值表示紅色程度，負(fù)值表示綠色程度；b值代表黃藍(lán)色度，正值表示黃色程度，負(fù)值表示藍(lán)色程度。總色差值（ΔE）按公式（3）計(jì)算。

式中：L*、a*、b*為標(biāo)準(zhǔn)白色板的色澤指數(shù)（L*＝99.76、a*＝－0.02、b*＝－0.40）。

1.3.4.5 透光率測(cè)定

參照GB/T 2410—2008《透明塑料透光率和霧度的測(cè)定》，將膜裁成正方形（50 mm×50 mm），采用WGW型光電霧度儀測(cè)定入射光通量（T1）和通過(guò)試樣的總透射光通量（T2），每組5 個(gè)平行，取平均值，按照公式（4）計(jì)算透光率（TS）。

1.3.4.6 力學(xué)性能的表征

參照GB/T 1040.1—2018《塑料 拉伸性能的測(cè)定第1部分：總則》，將薄膜剪成70 mm×15 mm尺寸的樣條，采用HD-A821-1型電子拉力試驗(yàn)機(jī)測(cè)定樣品的拉伸強(qiáng)度（tensile strength，TS）和斷裂伸長(zhǎng)率（elongation at break，EAB），設(shè)置初始間距為40 mm，拉伸速率為60 mm/min，測(cè)3 次取其平均值。

1.3.4.7 含水率和水溶性的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法測(cè)定薄膜含水率和水溶性，將膜樣（20 mm×20 mm）在室溫下稱質(zhì)量（m0/g），然后在105 ℃條件下干燥至恒質(zhì)量（m1/g）。將干燥后樣品放入裝有50 mL蒸餾水的離心管中，于25 ℃條件下浸泡24 h，并定時(shí)攪動(dòng)。將未溶解的膜取出，用濾紙吸干膜表面水分，于105 ℃干燥至恒質(zhì)量（m2/g）。根據(jù)公式（5）、（6）分別計(jì)算含水率和水溶性。

1.3.4.8 水蒸氣透過(guò)率測(cè)定

根據(jù)GB/T 1037—2021《塑料薄膜與薄片水蒸氣透過(guò)性能測(cè)定 杯式增重與減重法》，并略作修改后測(cè)定水蒸氣透過(guò)率。將4 mm×4 mm的薄膜預(yù)先放置在含直徑27.5 mm填充硅膠（相對(duì)濕度0%）的離心管口，并用橡膠圈密封，以確保濕度只通過(guò)薄膜遷移。將離心管儲(chǔ)存在一個(gè)含有飽和KNO3溶液的干燥器中，控制溫度為40 ℃、相對(duì)濕度為90%。每12 h檢測(cè)離心管質(zhì)量增加情況，連續(xù)測(cè)定7 d。所有分析均重復(fù)3 次，根據(jù)公式（7）計(jì)算水蒸氣透過(guò)率（water vapor permeation，WVP）。

式中：Δm表示每12 h的質(zhì)量差/g；d為樣品平均厚度/cm；A為離心管管口面積/cm2；Δt為測(cè)量間隔時(shí)間/s；ΔP為40 ℃下純水通過(guò)樣品的水蒸氣壓差/Pa。

1.3.4.9 氧氣透過(guò)率測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[21]的方法測(cè)定薄膜的氧氣透過(guò)率，取3 g脫氧劑加入到50 mL離心管，用薄膜封口后稱初始質(zhì)量（m1/g），然后將離心管放入盛有飽和氯化鋇溶液（相對(duì)濕度85%）的干燥器中48 h后稱質(zhì)量（m2/g）。每組測(cè)試重復(fù)3 次求平均值，根據(jù)公式（8）計(jì)算氧氣透過(guò)率（oxygen permeability，OP）。

式中：t為測(cè)定時(shí)間/h；A為離心管管口面積/m2。

1.3.4.10 抗氧化性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[22]的方法測(cè)定DPPH自由基清除率。取25 mg膜樣于5 mL無(wú)水乙醇中浸泡過(guò)夜得到提取液。將每份提取液（0.1 mL）與3.9 mL 0.01 mmol/L DPPH溶液混合，劇烈搖晃后，在環(huán)境溫度下黑暗中靜置30 min，然后使用Varioskan Flash型全波長(zhǎng)功能酶標(biāo)儀在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用無(wú)水乙醇代替提取液制備對(duì)照樣品。每組樣品3 個(gè)平行。DPPH自由基清除率按公式（9）計(jì)算。

式中：Aα為對(duì)照樣品的吸光度；Aβ為測(cè)試樣品的吸光度。

1.3.4.11 抗菌性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]采用瓊脂抑菌圈擴(kuò)散法測(cè)定薄膜的抗菌性能。選用2 種細(xì)菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）作為測(cè)試菌種涂布于LB培養(yǎng)基上，將各明膠薄膜裁剪為直徑為15 mm的圓形膜樣品，浸入戊二醛中交聯(lián)1 min后，在去離子水中浸泡30 s，用濾紙吸干多余水分，將膜片貼附于培養(yǎng)基表面，在37 ℃培養(yǎng)24 h后，拍照并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.4.12 香芹酚的釋放率測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[23]的方法測(cè)定香芹酚的釋放率。對(duì)復(fù)合膜中香芹酚在4 ℃、相對(duì)濕度50%條件下貯藏18 d過(guò)程中的釋放率進(jìn)行測(cè)定。首先，將薄膜裁剪成20 mm×20 mm正方形片，稱質(zhì)量后加入裝有20 mL 95%乙醇溶液的60 mL封頂瓶中。室溫25 ℃下振蕩提取12 h，取0.1 mL提取液，進(jìn)行梯度稀釋，利用VarioskanFlash型多模酶標(biāo)儀測(cè)定提取液在282 nm波長(zhǎng)處的吸光度。將不同質(zhì)量濃度香芹酚溶解在95%乙醇溶液制備標(biāo)準(zhǔn)品并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程確定香芹酚質(zhì)量濃度。按公式（10）計(jì)算香芹酚的釋放率。

式中：ρ為釋放達(dá)到終點(diǎn)時(shí)香芹酚的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρt為測(cè)試樣品t時(shí)間點(diǎn)釋放出的香芹酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 27.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用方差分析和鄧肯多重范圍檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），以O(shè)rigin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 D/C復(fù)合體的表征

如圖1A所示，數(shù)碼照片顯示硅藻土為白色無(wú)機(jī)黏土，而負(fù)載香芹酚后，所得復(fù)合體粉末變?yōu)榈S色，Lei Hong等[24]通過(guò)坡縷石負(fù)載生姜精油前后的顏色變化確定了精油的成功負(fù)載；此外，掃描電子顯微鏡結(jié)果直接證實(shí)負(fù)載香芹酚后，硅藻土的多孔結(jié)構(gòu)被吸入孔洞的香芹酚完全覆蓋。由圖1B粒徑分布曲線可以看出，硅藻土、D/C復(fù)合體兩組樣品均為單峰分布，平均粒徑約在30 μm左右；而相對(duì)于硅藻土，復(fù)合體由于負(fù)載香芹酚后平均粒徑略微增加且分布略微變寬。上述表征結(jié)果共同說(shuō)明多孔性的硅藻土成功負(fù)載了香芹酚。并由公式（1）、（2）計(jì)算出硅藻土和香芹酚在復(fù)合體中的相對(duì)含量分別約為32.56%和67.44%。

圖1 硅藻土和D/C復(fù)合體的結(jié)構(gòu)表征Fig. 1 Structural characterization of diatomite and D/C complex

如圖1C所示，香芹酚的特征吸收峰分別由在3 373 cm－1處和2 959 cm－1處羥基（—OH）和甲基（—CH3）的伸縮振動(dòng)引起；1 250～1 750 cm－1區(qū)域出現(xiàn)的吸收峰與C—C鍵伸縮、—OH鍵彎曲和C—O鍵伸縮有關(guān)；811 cm－1處的吸收峰可能歸因于芳香族—OH的伸縮振動(dòng)[25]。硅藻土的特征峰分別是在1 085 cm－1處硅氧烷（—Si—O—Si）的強(qiáng)吸收峰，以及在794 cm－1處SiO—H鍵的振動(dòng)峰，以上這些特征峰的出現(xiàn)表明硅藻土主要由SiO2組成[26]。對(duì)于D/C復(fù)合體，香芹酚和硅藻土的主要特征吸收峰均有出現(xiàn)，說(shuō)明兩者之間未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。與香芹酚的紅外光譜比較，D/C復(fù)合體紅外光譜在3 100～3 600 cm－1之間的吸收峰（與O—H伸縮振動(dòng)有關(guān)）變寬且強(qiáng)度降低，并向更高的波數(shù)轉(zhuǎn)移，表明游離O—H鍵伸縮程度減弱。這可能是由于香芹酚與硅藻土表面羥基之間的氫鍵發(fā)生相互作用從而使兩者的界面結(jié)合能力提高[27]，機(jī)理如圖1D所示。

2.2 復(fù)合明膠薄膜的表征

2.2.1 薄膜微觀結(jié)構(gòu)分析

由圖2可知，G-K膜的截面和表面均連續(xù)、光滑且致密，無(wú)明顯缺陷，證實(shí)明膠基質(zhì)成膜性良好。而加入香芹酚后，G-C膜的表面與G-K膜相比變化不大，但橫截面明顯變得粗糙且厚度增大。這是由于香芹酚的增塑作用增加了明膠基質(zhì)分子鏈之間的距離，從而使膜結(jié)構(gòu)的致密性減弱[28-29]。當(dāng)加入D/C復(fù)合體后，G-D/C3薄膜的厚度進(jìn)一步增大，同時(shí)因?yàn)閺?fù)合體中的硅藻土密度較大，在溶液成膜干燥時(shí)容易沉積在下表面[17]，因此表面更為粗糙。此外，D/C復(fù)合體中香芹酚的酚羥基可與明膠基質(zhì)中的羥基、羧基和氨基等極性基團(tuán)發(fā)生氫鍵等相互作用，提升了復(fù)合體與明膠基質(zhì)之間的界面相容性[30-31]，所以兩者結(jié)合較為緊密，并未出現(xiàn)明顯的界面分離。

圖2 G-K（A）、G-C（B）、G-D/C3（C）膜截面和表面的掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 SEM images of cross-section and surface of G-K (A), G-C (B)and G-D/C3 (C) films

2.2.2 薄膜紅外光譜分析

如圖3A所示，純明膠薄膜3 296 cm－1處的峰對(duì)應(yīng)N—H拉伸和O—H拉伸，2 931 cm－1處的峰對(duì)應(yīng)C—H拉伸振動(dòng)[32]；在大約1 634、1 549 cm－1和1 240 cm－1處的峰分別對(duì)應(yīng)酰胺I帶的C＝O拉伸、酰胺II帶的N—H變形和C—H拉伸，以及蛋白質(zhì)中酰胺III帶的C—H和N—H基團(tuán)在平面上的振動(dòng)[33]。摻入硅藻土和香芹酚，G-D/C3薄膜在3 000～3 600 cm－1處的頻帶強(qiáng)度明顯下降。此外，與G-K膜相比，G-D/C3膜的光譜中有明顯的酰胺I帶（1 690～1 630 cm－1）和酰胺II帶（1 655～1 590 cm－1）。由此可見(jiàn)，明膠基復(fù)合膜的帶位和強(qiáng)度發(fā)生了一些變化，但并未有新峰的產(chǎn)生，表明D/C復(fù)合體與明膠基質(zhì)之間沒(méi)有化學(xué)相互作用，只有物理分子間的相互作用[20]。這種作用可能是硅藻土對(duì)香芹酚的物理吸附和攜帶作用，以及蛋白基質(zhì)極性基團(tuán)與D/C復(fù)合體中香芹酚的酚羥基之間的氫鍵相互作用[31]。

圖3 復(fù)合膜的傅里葉變換紅外光譜（A）和表觀形貌（B）Fig. 3 Fourier transform infrared spectra (A) and apparent images (B)of the composite films

2.2.3 薄膜的厚度、色澤、透光率

由表1可知，G-K膜的厚度僅為84.67 μm，而復(fù)合膜的厚度隨著D/C復(fù)合體添加量的增加而顯著上升（P＜0.05），膜的厚度主要取決于成膜液中非溶劑成分的含量。如圖3B所示，明膠薄膜本身成淡黃色，隨著D/C復(fù)合體添加量的增加，薄膜黃色逐漸加深，這是由于香芹酚作為添加物質(zhì)其顏色偏淡黃色，從而導(dǎo)致膜的a值降低、b值增大。此外，復(fù)合膜中硅藻土為白色粉末狀黏土，因此添加硅藻土的復(fù)合膜與G-K相比ΔE降低。復(fù)合膜的透過(guò)率同樣隨著薄膜復(fù)合體的添加量增加而顯著降低（P＜0.05），特別是相比于G-K膜，G-D/C3膜的透光率降低了近20%。這是由于硅藻土本身作為無(wú)機(jī)物質(zhì)，具有不透明性，在膜中會(huì)阻礙光線的透過(guò)。Akyuz等[34]發(fā)現(xiàn)在殼聚糖薄膜中添加硅藻土同樣會(huì)顯著改善薄膜的光阻隔性能。同時(shí)，溶質(zhì)的量增加導(dǎo)致膜厚度變大，也會(huì)進(jìn)一步阻礙光線的透過(guò)。

表1 復(fù)合膜的厚度、色澤和透光率Table 1 Thickness, color difference and transmittance of the composite films

2.2.4 薄膜力學(xué)性能的表征

由圖4可知，可以觀察到G-C、G-D膜TS均較低。在復(fù)合薄膜中，隨D/C復(fù)合體添加量的增加，TS呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，由17.66 MPa（G-K）下降到了13.01 MPa（G-D/C3）。TS降低一方面是因?yàn)楸∧ぶ邢闱鄯拥膿]發(fā)會(huì)致使薄膜出現(xiàn)孔洞結(jié)構(gòu)，從而破環(huán)薄膜本身完整結(jié)構(gòu)[35]；另一方面，過(guò)多的復(fù)合體則可能會(huì)導(dǎo)致其在膜中的分散性降低，使顆粒發(fā)生團(tuán)聚，造成顆粒尺寸增大和周邊區(qū)域的應(yīng)力集中[36]。此外，G-C膜相比于G-D膜EAB顯著增加，因?yàn)橄闱鄯拥拇嬖跁?huì)對(duì)明膠薄膜產(chǎn)生增塑作用，降低明膠單體之間的相互作用，阻礙聚合物的鏈-鏈相互作用[37]。最終在復(fù)合膜中，EAB由G-K薄膜組的61.06%提升至G-D/C3薄膜組的80.45%。在D/C添加量為20%時(shí)，復(fù)合膜具備優(yōu)異的力學(xué)性能，其TS為15.13 MPa，EAB為67.43%。總地來(lái)說(shuō)，由于香芹酚的增塑作用，D/C復(fù)合體的加入可一定程度改善明膠膜的EAB。

圖4 復(fù)合膜的力學(xué)性能Fig. 4 Mechanical properties of the composite films

2.2.5 含水率、水溶性、水蒸氣透過(guò)率和氧氣透過(guò)率

由表2可知，復(fù)合膜的含水率和水溶性隨著D/C復(fù)合體添加量的增加而顯著降低，這歸因于D/C復(fù)合體中硅藻土作為無(wú)機(jī)填料不溶于水，增加了復(fù)合膜中不溶物質(zhì)的量。此外，香芹酚作為一種疏水性化合物，它的存在也有助于明膠膜的疏水性提升[34,38]。Hosseini等[28]將百里香、丁香、肉桂精油添加至殼聚糖中制備抗菌復(fù)合膜并測(cè)定其含水率和溶解度，也得到了類似的結(jié)果。然而值得注意的是，僅含有香芹酚的G-C膜水溶性最高，這可能是由于G-C膜中的香芹酚容易從明膠基質(zhì)遷移到浸泡的水中而損失[39]。

表2 復(fù)合膜的含水率、水溶性、WVP和OPTable 2 Water content, solubility, water vapor permeability and oxygen permeability of the composite films

G-C薄膜的WVP相較于G-K顯著增加。復(fù)合體中香芹酚的存在對(duì)明膠膜產(chǎn)生了一定的增塑作用，降低了明膠膜網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的內(nèi)聚力，從而導(dǎo)致WVP增加[7]。Kavoosi等[7]同樣發(fā)現(xiàn)在明膠膜中添加香芹酚可導(dǎo)致WVP的增加。G-D膜的WVP最高，為1.93×10－12g/（cm·s·Pa）。這是由于硅藻土顆粒的高孔隙率和聚集性，有利于水分子通過(guò)硅藻土內(nèi)部孔隙和聚合物基體界面區(qū)域的擴(kuò)散[40-41]。結(jié)果表明，D/C復(fù)合體的加入會(huì)降低復(fù)合膜含水率和水溶性，但使其WVP增大。

食品在保存過(guò)程中的氧滲透性是影響食品保質(zhì)期的一個(gè)重要因素[21]。如表2所示，G-C薄膜的OP相較于G-K有所增加，這是因?yàn)橄闱鄯拥脑鏊茏饔脤?dǎo)致明膠基質(zhì)分子間距增大，進(jìn)而使膜的連續(xù)性和緊密結(jié)構(gòu)受到影響；此外，隨著D/C復(fù)合體添加量的增加，復(fù)合膜的OP也呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，這是因?yàn)閺?fù)合體中多孔性硅藻土的存在同樣會(huì)破壞明膠基質(zhì)致密完整的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)空氣中氧分子的通過(guò)，造成復(fù)合膜的OP增大。說(shuō)明與G-K相比，復(fù)合膜的阻隔性能有所降低。

2.2.6 薄膜的抗氧化性和抗菌特性

2.2.6.1 抗氧化性

在明膠基質(zhì)當(dāng)中添加抗氧化活性物質(zhì)能夠有效抑制食品的氧化反應(yīng)進(jìn)而延長(zhǎng)食品貨架期[42]。如圖5所示，G-K、G-D均具有一定DPPH自由基清除效果，這是由于硅藻土本身并不具有抗氧化活性，但明膠中多肽具有一定的抗氧化活性[22,43]。而G-C與G-D/C3均表現(xiàn)出最高的DPPH自由基清除率，且二者無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。當(dāng)D/C復(fù)合體在明膠中添加量達(dá)到20%時(shí)，DPPH自由基清除率為56.33%。這是因?yàn)橄闱鄯泳哂休^強(qiáng)的抗氧化活性，它的抗氧化能力除了取決于其環(huán)的空間位阻效應(yīng)和電子效應(yīng)外，還與羥基的存在有關(guān)，羥基能夠提供氫原子與氧原子結(jié)合[44]。因此，可以發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)合體添加量的增加，復(fù)合的DPPH自由基清除率顯著提升（P＜0.05）。

2.2.6.2 抗菌性

如圖6所示，由于明膠本身不具有抗菌活性，G-K組并未產(chǎn)生抑菌圈。隨著加入復(fù)合體的添加量增加，復(fù)合膜樣片周圍透明的抑菌圈逐漸增大，說(shuō)明復(fù)合膜具有較好的抑菌活性。當(dāng)D/C復(fù)合體在明膠膜中添加量達(dá)到20%時(shí)，薄膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑可分別達(dá)到39.40 mm和23.70 mm（表3）。這主要?dú)w因于D/C復(fù)合體中香芹酚能快速提高細(xì)菌細(xì)胞膜通透性及滲透壓，造成胞內(nèi)物質(zhì)外泄，并且進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的酚類物質(zhì)可改變細(xì)菌酶系統(tǒng)，導(dǎo)致微生物死亡[45-46]。此外，復(fù)合膜對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性要強(qiáng)于對(duì)大腸桿菌的抑菌性。這是因?yàn)楦锾m氏陰性菌細(xì)胞壁通常會(huì)多一層脂蛋白層或磷脂層和脂多糖層，限制了酚類物質(zhì)與細(xì)菌內(nèi)部蛋白結(jié)合[45]。對(duì)比G-D/C3與G-C兩組，雖然它們含有等量的香芹酚，但G-D/C3的抑菌效果要略差于G-C。這可能與香芹酚被硅藻土負(fù)載后，在D/C復(fù)合體的釋放速率較為緩慢有關(guān)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步證實(shí)此推測(cè)。總地來(lái)說(shuō)，D/C復(fù)合體的加入成功賦予明膠復(fù)合膜優(yōu)異抗菌活性。

表3 復(fù)合薄膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑Table 3 Inhibition zone diameters of the composite films against S. aureus and E. coli

圖6 復(fù)合膜的抑菌性能Fig. 6 Antibacterial activities of the composite films

2.2.7 復(fù)合膜的香芹酚緩釋性能

2.2.7.1 G-D/C3和G-C薄膜貯藏過(guò)程中香芹酚的釋放率

香芹酚在薄膜放置過(guò)程中會(huì)因揮發(fā)而損失，導(dǎo)致復(fù)合膜的抗菌時(shí)效受到影響。由圖7可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，精油香芹酚在G-D/C3復(fù)合膜中的釋放率始終低于G-C薄膜。G-C復(fù)合薄膜中香芹酚在第14天左右便釋放完全，而G-D/C3薄膜中香芹酚在第18天才完全釋放，比前者延遲了4 d。這是由于在G-D/C3復(fù)合膜中，香芹酚的釋放可分為兩個(gè)階段：第一個(gè)階段為游離精油的揮發(fā)釋放（與G-C組相似）；第二階段為負(fù)載在硅藻土內(nèi)部精油的遷移揮發(fā)[18]。添加D/C復(fù)合體后，硅藻土的吸附負(fù)載能夠減緩香芹酚釋放的速率，有效降低其在明膠復(fù)合膜成膜和儲(chǔ)存過(guò)程的損失，有利于延長(zhǎng)復(fù)合膜的抗菌活性時(shí)效[47]。

圖7 G-D/C3和G-C膜中香芹酚的釋放率Fig. 7 Carvacrol release from G-D/C3 and G-C films

2.2.7.2 G-D/C3和G-C薄膜的抑菌性

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步測(cè)定了G-D/C3和G-C兩組復(fù)合膜對(duì)金黃色葡萄球菌連續(xù)培養(yǎng)5 d過(guò)程中抑菌圈直徑的變化，結(jié)果如圖8所示。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組抑菌圈直徑均有所減小，這與香芹酚的揮發(fā)損失有關(guān)。放置4 d后，G-D/C3薄膜抑菌圈直徑在不再縮小；而G-C薄膜抑菌圈直徑仍在不斷縮小。印證了G-D/C3薄膜中香芹酚釋放更為緩慢的結(jié)論。同時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)在4 d后G-C膜周圍出現(xiàn)多個(gè)單菌落，而G-D/C3膜中并未觀察到有類似明顯的變化。在貯藏結(jié)束時(shí)，G-D/C3薄膜抑菌圈直徑由0 d時(shí)的45 mm最終降低至37 mm，變化率為17.8%；而G-C薄膜抑菌圈直徑由0 d時(shí)的59 mm最終降低至44 mm，變化率為25.4%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有效證明了G-D/C3薄膜相較于G-C薄膜具有更加長(zhǎng)效的抑菌效果。

圖8 貯藏5 d過(guò)程中G-D/C3和G-C膜對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑變化Fig. 8 Change in inhibition zone diameter of G-D/C3 and G-C films against S. aureus during storage for up to five days

3 結(jié) 論

本研究利用多孔性的硅藻土負(fù)載易揮發(fā)的香芹酚制備D/C復(fù)合體，并將其加入到明膠膜溶液中，利用流延成膜法制得活性復(fù)合膜，探究了不同D/C復(fù)合體添加量對(duì)復(fù)合膜結(jié)構(gòu)與性能的影響。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察和傅里葉變換紅外光譜分析證實(shí)了香芹酚成功物理吸附在硅藻土內(nèi)部孔洞與表面，且兩者之間可能存在氫鍵等相互作用而有效結(jié)合。D/C復(fù)合體的加入顯著改善了明膠基復(fù)合膜的光阻隔性能、水不溶性和EAB，但同時(shí)也會(huì)使TS、WVP和OP有所降低。更為重要的是，D/C復(fù)合體的加入賦予了明膠膜良好的抗氧化性和抑菌性能。此外，與含等量香芹酚的G-C膜相比，硅藻土的負(fù)載可以使G-D/C膜中香芹酚具有更緩慢的釋放速率，有利于延長(zhǎng)復(fù)合膜的抗菌時(shí)效。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果能夠?yàn)橐詿o(wú)機(jī)硅藻土負(fù)載植物精油制備新型緩釋抗菌明膠基復(fù)合膜的研發(fā)及其在食品包裝方面的應(yīng)用提供一定參考。