溶血情況對免疫比濁法檢測過敏原IgE水平的影響分析

潘仁霞 陳麗惠 郭欽玉

平潭綜合實驗區醫院檢驗科,福建省平潭縣 350499

過敏性疾病是一種發展迅速的多系統綜合征,嚴重者甚至引起過敏性休克,威脅患者生命安全[1]。作為典型總免疫球蛋白E(Immu-noglobulin E,IgE)介導的過敏反應關鍵介質,IgE在臨床被作為診斷過敏性疾病的生物指標。熒光酶免疫法是血清IgE體外測定的“金標準”,但該檢查方法對儀器、環境、試劑要求嚴苛,且檢驗價格昂貴導致部分醫療機構,尤其是基層醫療機構選擇免疫比濁法檢測[2]。以往研究發現,血液樣本溶血會干擾免疫比濁法分析結果[3]。而在臨床實際工作中,血液樣本不可避免地受到采集方法、保存等的影響出現溶血。因此,有必要探明溶血對血清IgE分析的干擾,并找出減少溶血血樣中干擾的有效方法。鑒于此,本研究納入過敏性疾病患者血液樣本,旨在探討溶血情況對免疫比濁法檢測過敏原IgE水平的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2022年1—5月我院49例過敏性疾病患者為觀察對象。納入標準:(1)符合過敏性疾病的診斷標準,年齡20～50歲;(2)簽署知情同意書者。排除標準:(1)合并其他免疫性疾病者;(2)入組前1周使用相關抗過敏藥物者;(3)合并血液性疾病,凝血功能障礙等影響患者血清IgE測量水平的疾病者。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑。試劑:IgE免疫比濁法試劑盒及IgE標準品均來自Beckman Coulter。主要組成包括:反應緩沖液、鼠抗人IgE單克隆抗體乳膠粒、校準人IgE、牛血清白蛋白。儀器:Beckman Coulter IMMAGE 800特定蛋白分析儀。

1.2.2 血液樣本制備。采集49例過敏性疾病患者血液樣本10ml,取1ml未溶血的血液,在3 000g的離心條件下離心20min后取上清液,作為未溶血血清標本;另取1ml未溶血的血液在-20℃冷凍,并在室溫(約24℃)下緩慢解凍五個循環,以制備完全溶血的血液樣本。后取2ml未溶血血液以3 000g離心10min,收集所有上層血清作為用于總IgE分析和制備不同水平溶血血清樣品。將剩下血細胞與生理鹽水溶液混合至總體積為5ml,然后將混合物以3 000g離心10min,收集下層血細胞,棄去上清液,在混合—離心—丟棄的五個循環后,最終確保上清液總IgE濃度<0.1IU/ml。將反復洗滌后收集的血細胞通過反復凍融(參考完全溶血血液樣本制作),制備濃縮的溶血血樣,測定血紅蛋白濃度。根據血紅蛋白濃度,選取不同體積的濃縮溶血血樣和血清配比,制備血紅蛋白濃度分別為10g/L、20g/L、50g/L、100g/L、120g/L、150g/L、200g/L,體積均為200μl的不同溶血樣本。樣本制備完成后儲存在-80℃,用于IgE的檢測分析。

1.2.3 血清IgE測量。所有不同溶血水平的樣本均根據檢驗操作流程采用免疫比濁法測定血清總IgE。

2 結果

2.1 不同程度溶血過敏原IgE水平的影響 混合物中總IgE的測試濃度低于相應的計算濃度,并且|偏差(%)|隨著溶血水平的增加而增加,表明溶血對通過免疫比濁法檢測的血清IgE分析產生負面干擾,并且溶血越嚴重,干擾越大,見表1。

表1 不同溶血程度血清的測試濃度、計算濃度和|偏差(%)|(n=49)

2.2 稀釋后計算濃度與血清濃度差異 將49例完全溶血樣本[HB:(135.27±43.37)g/L]用9倍體積的生理鹽水自動稀釋至最終血紅蛋白濃度低于20g/L[HB(13.71±4.52)g/L]。結果顯示:稀釋后樣本測試濃度乘以10得出計算濃度(范圍:1.74～541.00IU/ml,中值:21.33IU/ml),顯著低于血清總IgE濃度(范圍:3.62～943.79IU/ml,中值:40.13IU/ml)(P<0.05),表明僅稀釋完全溶血的血液不能用于估計血清IgE水平。

2.3 完全溶血血液和血清總IgE濃度的線性回歸分析 對所有49個樣本進行了線性回歸分析,結果顯示完全溶血血液總IgE的測試濃度(x)與相應血清總IgE的測試濃度(y)顯示正相關,回歸公式為y=1.721x+5.78(r=0.572),見圖1。使用回歸公式矯正完全溶血血液總IgE的測試濃度,并獲得矯正后的濃度(范圍:19.53～933.57IU/ml,中位數:52.25IU/ml),該濃度與血清總IgE的濃度無顯著差異(P=0.435),見圖2。證實用稀釋矯正法獲得的矯正濃度來估計血清IgE水平的可行性。

圖1 完全溶血血液和相應血清中總IgE濃度的線性回歸分析

圖2 血清和完全溶血血液總IgE的濃度及矯正后的濃度

2.4 矯正濃度的診斷能力驗證 為了進一步驗證矯正濃度的有效性,比較了血清、完全溶血血液和矯正濃度總IgE診斷能力,結果顯示:矯正濃度診斷的AUC為0.892,完全溶血血液為0.828,血清為0.908,表明通過稀釋矯正方法獲得的矯正濃度具有與血清相同的診斷能力。見圖3。

圖3 矯正濃度IgE對過敏性疾病診斷能力驗證

3 討論

IgE是在過敏原等刺激物刺激人體后,人體漿細胞與B細胞釋放的過敏性介質,由于過敏性疾病缺乏特異性形態學改變,導致IgE成為過敏性疾病診斷與治療過程中重要的參考指標[4]。免疫比濁法是測量血清IgE的重要手段,但有研究指出,血清IgE含量極低,檢測難度大,而獲取的血液樣本溶血后血細胞釋放的胞內物質可能影響血清IgE的濃度,進而影響血清IgE測量水平[5]。然而,臨床實際工作中,血液樣本溶血無可避免,因此,探明溶血對免疫比濁法測量血清IgE分析的干擾,對提高檢測結果準確性具有重要意義。

本研究結果表明,不同溶血程度血液樣本總IgE均低于血清樣本測試濃度,溶血對免疫比濁法檢測的血清IgE分析產生負面干擾,并且溶血越嚴重,干擾越大。通常情況下血液中正常的血紅蛋白濃度男性為130～160g/L,女性為120～150g/L,在通過免疫比濁法進行分析時,由于溶血干擾,完全溶血的血液樣品總IgE減少約20%。此外,溶血后血細胞釋放的血紅蛋白會干擾抗原和抗體的結合影響檢測的進程,溶血后血細胞釋放的胞內物質還可能影響血清生物標志物的濃度[6];同時血紅蛋白在光譜中具有強吸收峰,影響檢測結果讀取[7]。

本研究通過稀釋完全溶血血液分析稀釋法是否能用于血清IgE水平檢測,評估發現,完全溶血血液總IgE的測試濃度(根據稀釋換算)比血清濃度低,推測可能的原因為溶血后血細胞釋放的細胞內物質可能有助于稀釋血清總IgE,導致完全溶血血液總IgE的測試濃度比血清濃度低大約2倍。在臨床上若通過測量完全溶血血液總IgE的測試濃度高于臨界值,則結果可被視為陽性,但若完全溶血血液測試濃度低于臨界值,則不能排除假陰性值。因此,僅稀釋的完全溶血血液不能用于估計血清IgE水平。既往研究也指出,溶血可影響血清生物標志物的測量[8]。線性回歸分析顯示完全溶血血液總IgE的測試濃度與相應血清總IgE的測試濃度呈正相關(r=0.572),使用回歸公式矯正完全溶血血液總IgE的測試濃度顯示,矯正完全溶血血液總IgE濃度與血清總IgE的濃度無顯著差異,ROC曲線分析顯示,矯正濃度診斷能力與血清IgE相當。因此,筆者認為,當溶血嚴重且血清不可用時,矯正后的完全溶血血液總IgE濃度可用于評估血清中總IgE的濃度以進行診斷。

綜上所述,僅稀釋的完全溶血血液不能用于估計血清IgE水平,但用矯正法獲得的矯正濃度來可用于估計血清IgE水平,且矯正完全溶血血液IgE濃度具有與血清相同的診斷能力。