基于MTB基因分型的精準醫療對結核病傳染情況的影響*

向長港 童勝蘭 徐曙玲 高媚媚 孫 曼 劉本德

湖北省武漢市江夏區第一人民醫院 430200

結核病為結核分枝桿菌(MTB)感染導致的一類疾病,有著較高的致死率,通常多出現在肺部,也能出現在其他的器官或者組織,例如骨結核以及腦結核等[1]。我國屬于結核病感染較為嚴重的國家,掌握疾病傳播規律是開展結核病防控工作的關鍵[2]。因此,對當地開展結核病傳染流行病學分析,掌握近期傳播率意義重大。另一方面伴隨臨床上抗結核藥物廣泛以及不合理應用,使得MTB產生耐藥性,其危害會嚴重威脅人們的健康以及生命安全[3]。雖人們已對耐藥結核進行了較多研究,包含耐藥結核病診斷、結核分枝桿菌耐藥機制和耐藥結核病防治等方面,但目前臨床依舊無治愈疾病的有效方法。精準醫療是一類將個人基因、環境和生活習慣差異等考慮在內的疾病預防和處置的新方法,是當下疾病醫學治療的前沿探索。近些年來,伴隨高通量測序有關技術迅速發展及測序成本驟減,全基因組測序逐漸被使用到各類疾病致病機制和藥物治療等方面[4]。基于此,采取基因組測序測定MTB開展分子流行病學研究,和患者具體信息結合監測當地的結核病近期傳播情況,對分析結核病疫情、擬定有效干預措施以控制疾病流行有著重要意義。本文現對2020年1—12月本地區98例結核病患者的98株MTB和2021年1—12月本地區100例結核病患者的100株MTB進行研究,分析精準醫療下基于MTB基因分型的結核病傳染情況,具體內容如下。

*基金項目:湖北省衛生健康委員會科研項目(WJ2021M042)。通信作者:劉本德

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2020年1—12月本地區98例結核病患者的98株MTB和2021年1—12月本地區100例結核病患者的100株MTB進行研究,鑒定結果均是MTB,并選擇標準菌株H37Rv當作對照,由中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑:結核分枝桿菌藥敏和菌種鑒定培養基為珠海貝索生物技術有限公司提供;2倍PCR預混液、D2000 DNA marker以及瓊脂糖由北京永興生科科技有限公司提供,引物是北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.2.2 菌株培養:將每100ml基礎培養基內加入1ml配制稀釋過的抗結核藥物,充分混勻,無菌分裝成為7ml/管,在85℃環境內進行50min凝固處理,對制作而成培養基37℃開展無菌試驗之后放到4℃環境下避光保存,有效期是1個月。

1.2.3 藥敏試驗:采取比例法,嚴格依據有關標準程序開展操作,所用的藥物主要包含異煙肼、利福平、鏈霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等,終濃度依次是0.2μg/L、40.0μg/L、2.0μg/L、30.0μg/L、4.0μg/L。當耐藥百分比不低于1%時,說明受試菌對于該藥存在耐藥現象;相反,則代表受試菌對于該藥敏感。

1.2.4 MTB有關DNA提取:刮取培養基斜面中生長較好的結核分枝桿菌1標準環,在400μl的TE緩沖液(酸堿度值為8.3)內懸菌,在85℃環境下開展30min滅活處理,在100℃環境下進行10min煮沸,以12 000r/min速度進行10min離心處理,后選擇上清液為DNA模板,放到-20℃的環境內保存待測。

1.2.5 全基因組測序方法:由北京諾禾致源生物科技股份有限公司進行檢測,選擇高通量的二代Illumina測序平臺,開展DNA片段有關文庫構建,予以雙端測序,PE150,深度≥200×,各樣品的總測序深度有關數據量不低于1G Clean Data。測序的原始數據分別是Scythe、Sickle兩個軟件開展濾過,低質量堿基(即質量不超過38)、N堿基比例超過10bp、和Adapter之間overlap超出15bp與可能源自宿主reads,獲得的Clean Data被應用到后續分析中。將H37Rv菌株有關全基因組序列當作參考模板,采取BioEdit軟件開展對比獲取單株菌株單核苷酸多態性(SNP)。后將SNP數據和已經報道的MTB耐藥基因突變數據庫開展比較,得到每株菌株對于一線類抗結核藥物耐藥突變基因類型。菌株分型是每株菌株SNP和H37Rv開展比較,得到每株菌株基因型。

1.2.6 治療方法:2020年患者采取常規治療措施,即2HRZE/4HR化療方案,異煙肼片(上海信誼藥廠有限公司,100mg×100片,國藥準字H31020495)0.3g/d;利福平膠囊(上海衡山藥業有限公司,0.15g×100片,國藥準字H31021101)0.45g/d;吡嗪酰胺片(上海信宜藥廠有限公司,0.25g×100片,國藥準字H31020800)1.5g/d;鹽酸乙胺丁醇片(廣東臺城制藥股份有限公司,0.25g×100片,國藥準字H44023635)0.75g/d。以上4類藥物口服2個月,后繼續口服4個月的異煙肼片和利福平膠囊。2021年患者采取精準治療方案,即結合患者的MTB藥敏試驗、基因測序分型情況,并和其年齡、性別、居住地及日常作息等方面予以個體化治療,并與臨床醫師直接溝通,對患者信息進行持續追蹤,合理調整治療方案。

1.3 觀察指標 比較2年內MTB耐藥率、成簇率以及近期傳播率變化,并統計MTB耐藥基因分布情況。耐藥率=耐藥數/總數×100%;結合基因型是否相同評定菌株為成簇或者獨立,其中完全相同VNTR基因型菌株不低于2個為成簇[5];近期傳播率按照(nc-c)/n的公式計算,其中nc為成簇菌株,c是菌株成簇數,n是所有菌株樣本[6]。此外,比較2年內患者的療效差異,包含治愈率和再傳染率兩項指標,將治療后患者連續3次痰涂片轉陰評定成治愈,治愈率=治愈數/總數×100%;再傳染率=未治愈人數/總數×100%[7]。

2 結果

2.1 2年內MTB耐藥率變化情況相比 和2020年相比,2021年MTB耐藥率和耐多藥率有一定升高(P<0.05),見表1。

表1 2年內MTB耐藥率變化情況比較

2.2 2年內MTB成簇率以及近期傳播率變化比較 和2020年相比,2021年MTB成簇率和近期傳播率有一定升高(P<0.05),見表2。

表2 2年內MTB成簇率以及近期傳播率變化比較

2.3 198株MTB耐藥基因分布情況 對幾類藥物耐藥基因的分布情況開展統計后發現,占比最高的基因是katG基因,

為17.68%;其次是rpoB基因,為13.13%。幾類藥物中吡嗪酰胺耐藥基因占比總體處在較低水平,見表3。

表3 198株MTB耐藥基因分布情況

2.4 2年內療效比較 2021年患者的治愈率高于2020年患者,再傳染率低于2020年患者(P<0.05),見表4。

表4 2年內療效比較[n(%)]

3 討論

肺結核屬于一類常見呼吸道傳染病,是MTB感染所致,當前已經成為備受關注的一個重要公共衛生問題。據有關資料顯示[8],全球范圍內每日有約5 000人因結核病而死亡,在以往200年中共有10億人因結核病死亡。MTB基因分型屬于一類分子流行病學有關研究方法,其將基因分型技術和流行病學資料結合,對來源不同的MTB開展基因特性對比,以揭示結核病流行和傳播規律,是結核病監測中的有效措施。同時這項技術從分子水平方面對傳染源追蹤與溯源、劃分外源性感染和內源性復燃等具備重要價值,當前已被廣泛使用到流行病學中[9]。本次研究發現:對198株MTB耐藥基因突變情況開展檢測,得出占比最高的基因是katG基因,為17.68%;其次是rpoB基因,為13.13%;幾類藥物中吡嗪酰胺耐藥基因占比總體處在較低水平。該結果一定程度反映出本地區的吡嗪酰胺耐藥水平,提示一線抗結核藥吡嗪酰胺于本地區依舊具備較高應用價值。

和2020年相比,2021年MTB耐藥率、耐多藥率以及MTB成簇率、近期傳播率有一定升高(P<0.05),說明本地區的結核病耐藥現象正不斷加重,疾病的防控形勢依然較為嚴峻。考慮原因可能是近年來部分結核病患者于綜合醫院內接受治療,無法確保完成全程治療,而不規則的抗結核治療屬于生成耐藥菌的主要因素;患者治療期間的依從性不佳,癥狀略微改善就盡早停止用藥,也會引起結核菌耐藥現象,導致病情進一步傳播[10-12]。因此,需要提高對結核病患者治療工作的重視程度。精準醫療理念的提出使得結核病防治進入了精準醫學時代,對提升結核病治療水平、阻斷疾病在人群內的傳播有著重要意義[13]。本文研究顯示:2021年患者的治愈率高于2020年患者,再傳染率低于2020年患者(P<0.05),說明對結核病患者開展精準治療能提升其治愈率,降低疾病再傳染率。分析原因是精準治療和患者的實際情況更符合,能使各項治療措施的效果最優化,進而提升對疾病的防治效果。

總而言之,MTB耐藥率、成簇率以及近期傳播率近年來呈現升高趨勢,且吡嗪酰胺的耐藥基因占比相對較低,臨床需提高對結核病傳播以及治療工作的重視程度,結合患者具體情況開展精準醫療,以提升患者療效,控制疾病傳播。但本文依舊有不足之處,如納入的樣本數量不多,樣本全部源自同一家醫院,且未對患者的遠期隨訪結果進行統計,得到的結果有局限性,這些均需在日后加以完善,獲得更為全面的結果,更好地指導臨床實踐。