胃癌腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)差異基因的研究*

安覃景 劉 麗 李曉松

首都醫(yī)科大學(xué)石景山教學(xué)醫(yī)院 北京市石景山醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京市 100043

胃癌是世界上最常見的腫瘤之一,目前其主要的治療方法是手術(shù)切除和放化療,現(xiàn)有的治療方法對正常組織和細(xì)胞都有較大的損傷且治愈率較低[1],因此對于胃癌患者來說,選擇合適的治療方法顯得更為重要。而免疫治療目前已成為一種新興的治療方法,其對患者影響小,治愈率較高。免疫治療的主要方式是激發(fā)患者自身免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷和清除作用,從而起到治療作用。胃癌的腫瘤突變負(fù)荷(Tumor Mutation Burden, TMB)是影響免疫治療的關(guān)鍵因素之一,其反映了基因的突變密度,其與免疫反應(yīng)之間存在一定的相關(guān)性,TMB越高,其突變的細(xì)胞越多,免疫系統(tǒng)越容易發(fā)現(xiàn),則免疫治療效果越好[2]。以往的研究對胃癌的TMB進(jìn)行分析,僅發(fā)現(xiàn)了高 TMB 的患者生存及預(yù)后較好,但未明確找到影響TMB高低的Hub關(guān)鍵基因,從而不能為治療方式的選擇提供幫助。因此本研究以胃癌TMB為研究對象,篩選出影響胃癌腫瘤突變負(fù)荷高低的Hub關(guān)鍵基因,旨在為其靶向免疫治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究的所有TMB數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)均來自癌癥和腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫。共納入 441 例病例,本研究完全符合TCGA提供的發(fā)表指南。

1.2 高低TMB差異基因分析 使用 R 軟件中的“l(fā)imma”包對高低腫瘤突變負(fù)荷進(jìn)行差異基因分析。根據(jù) TMB 中值確定高和低 TMB 組,大于中值為高TMB組,小于中值為低TMB組。這項(xiàng)研究的截止值是|log2foldChange|>1.0 且調(diào)整后的P<0.05。

1.3 基因本體富集分析及KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析 使用R軟件(3.6.0版)中的“clusterProfiler”包對獲得的差異基因進(jìn)行基因本體富集分析和KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析。截止值調(diào)整為P<0.05。

1.4 TMB與生存的關(guān)系 本研究使用 R 軟件的“survival”包(版本 3.6.0)對高低 TMB 樣本進(jìn)行生存分析。當(dāng)P<0.05 時,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有數(shù)據(jù)分析均使用R 3.6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所使用的數(shù)據(jù)P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人口特征 該研究共納入 32 個正常樣本和 375 個腫瘤樣本,總共來自 441 例病例。

2.2 差異分析基因 根據(jù)TMB值對mRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分組,對TMB高低組進(jìn)行差異基因分析,根據(jù)篩選條件發(fā)現(xiàn)了491個差異基因。

2.3 GO富集分析和KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析 對mRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)的高、低TMB組的差異基因進(jìn)行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)它們主要集中在3個途徑:生物過程(Biological Process,BP)、細(xì)胞成分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF),具體結(jié)果見圖1。同時,對KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行了分析,見圖2。最后,還進(jìn)行了PPI分析,發(fā)現(xiàn)7個Hub基因?yàn)镸YH11、TAC1、ALB、AOX1、DMD、FGFR1、IGF1,見圖3。

圖1 GO富集分析

圖2 KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析

2.4 生存分析 對高、低TMB組進(jìn)行的生存分析顯示,高TMB組的5年生存率顯著高于低TMB組(P=0.007)。 其中,高TMB組為41.8%,低TMB組為28.3%,見圖4。

圖4 生存分析

3 討論

胃癌是全世界較為常見的消化道腫瘤之一,也是亞洲國家每年癌癥相關(guān)死亡的主要原因,在中國大多數(shù)患者被診斷時多已發(fā)展為晚期疾病,生存率低且預(yù)后較差[3]。TMB是反映機(jī)體對免疫反應(yīng)的大小的一項(xiàng)指標(biāo),體細(xì)胞突變的積累是腫瘤發(fā)生的主要原因之一,并有助于新抗原的表達(dá),新抗原通過識別腫瘤細(xì)胞上的靶抗原,激活T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用,其不僅可以影響腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和治療耐藥性,而且還能促進(jìn)免疫檢查點(diǎn)阻斷劑療法的反應(yīng)預(yù)測。然而目前與其相關(guān)的關(guān)鍵基因尚未明確,因此本研究對胃癌TMB進(jìn)行分析,以期找到相關(guān)差異基因,從而為胃癌的治療提供新思路。

本研究中GO富集分析主要集中在肌肉收縮、細(xì)胞外基質(zhì)和肝素結(jié)合等,而KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析發(fā)現(xiàn)涉及的通路包括血管平滑肌收縮、擴(kuò)張型心肌病等,這與以往的研究結(jié)果一致[4-5]。

在本研究中,發(fā)現(xiàn)了高低負(fù)荷組之間的差異表達(dá)基因中的最為關(guān)鍵的7個Hub基因是MYH11、TAC1、ALB、DMD、FGFR1、IGF1和AOX1。

肌球蛋白重鏈11(Myosin Heavy Chain 11,MYH11)基因產(chǎn)物是一個六聚體蛋白的亞基,由兩個重鏈亞基和兩對不相同的輕鏈亞基組成。Wang J等[6]的研究表明MYH11通過結(jié)合TNFRSF14啟動子抑制TNFRSF14的表達(dá),而TNFRSF14可逆轉(zhuǎn)MYH11對胃癌細(xì)胞惡性表型的抑制作用。He F等[7]進(jìn)行了胃癌的WGCNA分析,發(fā)現(xiàn)了與衰老分子表型相關(guān)的關(guān)鍵基因(ACTA2、CALD1、LMOD1、MYH11、MYL9、MYLK和TAGLN),這些基因在腫瘤中特異性上調(diào),與預(yù)后不良相關(guān)。在本研究中,MYH11在低突變負(fù)荷中高表達(dá),從而不被免疫細(xì)胞識別,導(dǎo)致預(yù)后不良,這與之前的結(jié)果一致。速激肽1(Tachykinin-1,TAC1)通過選擇性剪接、轉(zhuǎn)錄編碼神經(jīng)肽物質(zhì)P、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)肽K和γ,主要參與胃分泌、運(yùn)動、黏膜免疫和細(xì)胞增殖。David S等[8]采用實(shí)時熒光定量PCR方法發(fā)現(xiàn)了胃癌患者中TAC1甲基化更為普遍 (P<0.01)。另外,還有研究表明TAC1啟動子高甲基化在食管癌中較為常見,發(fā)生較早,與食管腺癌發(fā)生的其他進(jìn)展危險因素相關(guān),是ESCC預(yù)后不良的組織生物標(biāo)志物[9]。在本研究中,TAC1在低突變負(fù)荷中高表達(dá),不易被免疫細(xì)胞識別,因此更易導(dǎo)致患者預(yù)后不良。白蛋白(Albumin,ALB)是反映機(jī)體營養(yǎng)狀況的一項(xiàng)很重要的指標(biāo)。Alkurt EG等的研究表明較高的術(shù)前CRP/ALB的比值可以預(yù)測局部晚期胃癌患者的不良預(yù)后[10]。在本研究中,ALB在高突變負(fù)荷中高表達(dá),更容易被免疫細(xì)胞識別,患者預(yù)后較好。

DMD是一個具有 79 個外顯子的大基因,可編碼肌肉必需的抗肌萎縮蛋白,這是一種突變會導(dǎo)致肌肉紊亂的基因。在骨骼肌外,DMD最主要和普遍存在的基因產(chǎn)物是Dp71,其中至少有14個剪接亞型已被鑒定。Tan S等[11]的研究表明104例胃癌患者中,72.2%的患者Dp71表達(dá)被抑制,而Dp71表達(dá)降低與腫瘤分化程度(P=0.001)和淋巴管侵犯程度(P= 0.041)顯著相關(guān)。在本研究中,DMD在胃癌的低突變負(fù)荷中高表達(dá),這可能會使癌細(xì)胞遷徙、侵襲和增殖變快,從而導(dǎo)致患者預(yù)后較差,這與之前的結(jié)果一致。成纖維細(xì)胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factor Receptor,FGFR)家族由FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4 4個成員組成,它們通過與成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)相互作用激活,導(dǎo)致下游信號通路的激活,其中FGFR1屬于酪氨酸受體激酶,具有多種生物學(xué)功能,如增殖、生存、遷移和分化等。另外還有研究表明,FGFR1基因的下調(diào)可抑制胃癌細(xì)胞的惡性表型,其高表達(dá)與腹腔灌洗細(xì)胞學(xué)和同步的腹膜播散陽性以及預(yù)后不良顯著相關(guān)[12]。在本研究中,其在胃癌的低突變負(fù)荷中高表達(dá),胃癌細(xì)胞增殖侵襲變快,患者預(yù)后較差。

胰島素樣生長因子1 (Insulin-like Growth Factor 1,IGF1)是肌肉和骨骼發(fā)育所必需的,也是生長激素作用的主要介質(zhì)。Li H等[13]的研究表明IGF1通過GSK-3β和ZEB2誘導(dǎo)BGC-823胃癌細(xì)胞系上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,從而參與腫瘤的轉(zhuǎn)移。在本研究中其在低突變負(fù)荷中高表達(dá),使癌細(xì)胞更易轉(zhuǎn)移擴(kuò)散,患者預(yù)后較差。

醛氧化酶1(Aldehyde Oxidase 1,AOX1)是一種具有廣泛底物的氧化酶,包括多種芳香氮雜環(huán)和醛。此外,它還參與藥物前體的生物活化、氧平衡的調(diào)節(jié)、一氧化氮的產(chǎn)生和脂肪的形成。Narci K等[14]發(fā)現(xiàn)AOX1和AGER作為PI3K/Akt/mTOR通路的靶點(diǎn)參與了這種聯(lián)合增殖作用,siRNA敲除AOX1和AGER后,肝細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖明顯降低。但目前尚無AOX1在胃癌方面的研究,本文發(fā)現(xiàn)AOX1在胃癌的低突變負(fù)荷中高表達(dá),其不易被免疫細(xì)胞識別,更易進(jìn)行細(xì)胞侵襲、增殖,導(dǎo)致患者預(yù)后較差。

綜上所述,本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中的胃癌數(shù)據(jù)進(jìn)行腫瘤突變負(fù)荷的相關(guān)差異基因分析,篩選出了7個Hub關(guān)鍵基因,其中首次發(fā)現(xiàn)AOX1基因可能在胃癌的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用,針對關(guān)鍵基因選擇靶向治療,可能會產(chǎn)生更好的效果,這為胃癌的免疫治療提供了新思路。