不同微生物誘導家蠶蛹血淋巴抑菌活性分析

李慶榮 肖 陽 邢東旭 張偉龍 楊 瓊

（廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所 廣東廣州 510610）

我國蠶桑資源極為豐富，桑園種植面積超過1 300萬畝，蠶蛹年產量30萬t以上。蠶蛹中蛋白質含量較高，占其干物質重的45%～50%，蠶蛹蛋白是一種比大豆蛋白更具營養價值的優質蛋白質資源。近幾年蠶蛹肽蛋白在大口黑鱸、鳊魚、草魚、鴨嘴魚、南美白對蝦、羅氏沼蝦等養殖上的應用研究表明，蠶蛹肽蛋白能明顯降低飼料成本，提高水產養殖生物生長速度，降低餌料系數等[1-3]。蠶蛹不僅是優質蛋白原料，還富含黃酮、抗菌肽、誘食肽等功能性活性物質。其中，抗菌肽是家蠶蛹血淋巴內重要的抑菌物質，具有提高動物生產性能、增強動物免疫力、促進機體的新陳代謝等生物學功能[4]。在水產養殖方面，小型生態系統生物繁多，抗生素飼料添加劑容易在諸多生物體內殘留，不利于生態環境良性循環，而抗菌肽替代抗生素可增強水產養殖生物對病原微生物的抵抗力。有研究表明，用抗菌肽喂養魚可以提高其生長性能，提高魚血清中抗氧化酶的活性，最終會增加魚的體重（DG）、特定生長率（SGR）等，在對抗水產養殖中的病原性感染方面有著重要的作用[5-7]。但是，家蠶體內天然抗菌肽豐度相對較低，抗菌活性不足，特異性不強，無法完全抵抗病原菌的入侵。有研究表明，微生物誘導可以提高家蠶蛹體內相關抗菌肽的表達水平，提高其抑菌活性[8]。理論上，微生物誘導家蠶蛹后，提高了蠶蛹體內抗菌肽表達量，從而能夠提高血淋巴的抑菌活性，因此本研究采用不同微生物誘導家蠶蛹，分析家蠶蛹血淋巴對水產養殖過程中不同病原微生物的抑菌活性的差異，為人工誘導蠶蛹提高其血淋巴抑菌活性，開發蠶蛹功能性飼料添加劑提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

家蠶幼蟲及蠶蛹：在正常飼養條件下飼養的5齡家蠶幼蟲及家蠶蛹，來源于廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所。

白僵菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蟲草菌、美人魚發光桿菌、哈維氏弧菌、維氏氣單胞菌等試驗菌株均為廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所蠶桑南藥與微生物資源加工利用研究室留存。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物誘導蠶（蛹）的方法

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蟲草菌、美人魚發光桿菌、哈維氏弧菌、維氏氣單胞菌劃線培養后，挑取單菌落，分別接種入營養肉湯培養基和BHI培養基中，30 ℃、180 r/min過夜培養。將一定數量凍存的白僵蠶放入含5‰吐溫-80的無菌水中，攪拌20 min，過濾，獲得白僵菌懸液。將過夜培養的菌液和白僵菌懸液分別配置成106CFU/L～107CFU/L的懸液后，分別采用3種誘導方式處理蠶（蛹），比較誘導后蠶（蛹）血淋巴上清液的抑菌活性。誘導方法包括：（1）蠶蛹注射法。無菌微量注射器注射蠶蛹腹部，每個蛹注射1 μL菌懸液，放置24 h～96 h；（2）幼蟲喂食法。將桑葉在菌懸液中浸泡后立即取出，喂食5齡幼蟲；（3）噴灑法。將配置好的菌懸液均勻噴灑到蠶蛹的表面。

1.2.2 蠶蛹血淋巴抑菌活性檢測

取誘導后的蠶蛹血淋巴，煮沸5 min后，離心取上清，獲得血淋巴上清，4 ℃保存備用。分別配制含有5×106CFU/L大腸桿菌、美人魚發光桿菌、哈維氏弧菌、維氏氣單胞菌等菌株的培養基，倒平板，待其凝固后，用打孔器打孔，每孔加入20 μL的誘導血淋巴上清。陰性對照為孔內加入20 μL未誘導的血淋巴上清或無菌水，陽性對照為孔內加入5 μL 100 μg/mL的氨芐青霉素，靜置吸收后，30 ℃倒置培養過夜，觀察抑菌圈大小。

2 結果及分析

2.1 不同微生物菌株誘導家蠶蛹血淋巴的抑菌活性差異

利用平板抑菌法檢測注射不同微生物菌株誘導家蠶蛹后其血淋巴上清的抑菌效果，結果如圖1所示。檢測發現：經白僵菌誘導后的家蠶蛹血淋巴上清液對魚類廣譜病原菌美人魚發光桿菌、維氏氣單胞菌及哈維氏弧菌有顯著的抑菌效果，而其他檢測的微生物菌株誘導后，除美人魚發光桿菌誘導的家蠶蛹血淋巴上清對美人魚發光桿菌、維氏氣單胞菌有一定的抑菌效果外，其余病原菌誘導的家蠶蛹血淋巴上清對美人魚發光桿菌、維氏氣單胞菌及哈維氏弧菌均沒有明顯抑菌效果。

圖1 不同微生物誘導后家蠶蛹血淋巴的抑菌效果

2.2 不同誘導方式處理后家蠶（蛹）血淋巴抑菌活性分析

比較分析蠶蛹注射、幼蟲喂食及蠶蛹表面噴灑白僵菌后不同時間家蠶（蛹）血淋巴抑菌活性的差異，結果如圖2所示。可以看到，注射和噴灑蠶蛹表面1 d和3 d的血淋巴上清液在大腸桿菌培養基中產生的抑菌圈明顯，而喂食含有白僵菌孢子的桑葉1 d和3 d后的蠶幼蟲血淋巴對大腸桿菌沒有明顯的抑菌效果。為后期批量誘導易操作考慮，在后續的分析中，采用噴灑病原菌的方式開展下一步試驗。

圖2 不同誘導方式處理的家蠶（蛹）血淋巴對大腸桿菌的抑菌效果

2.3 白僵菌誘導不同時間的抑菌結果分析

取噴灑白僵菌后不同時間的家蠶蛹血淋巴進行抑菌圈檢測，結果如圖3所示。從圖3可以看出：在誘導12 h～96 h的時間范圍內，誘導的家蠶蛹血淋巴對所檢測病原菌都有抑菌效果，而正常未經過誘導的蠶蛹血淋巴、無菌水等對所檢測病原菌沒有明顯抑制效果。其中48 h和72 h的抑菌效果最好，說明在后期的應用中，2 d～3 d為最佳誘導時間。

圖3 白僵菌誘導不同時間的家蠶蛹血淋巴的抑菌效果

3 分析與討論

抗菌肽是一類具有抗菌活性的堿性多肽物質，具有抗菌譜廣、無殘留、殺菌速度快等優點，是水產養殖過程中無抗飼料添加劑的優質替代品。正常情況下，家蠶體內抗菌肽豐度低、活性不足，在外源微生物侵染的情況下，大部分抗菌肽誘導性表達，家蠶體內抗菌肽含量提高，對病原微生物的抑菌活性增加。

本文通過對喂食、注射及噴灑三種病原誘導方式的分析發現，家蠶蛹對注射和噴灑白僵菌比較敏感，誘導后血淋巴上清的抑菌效果顯著，而對幼蟲喂食浸泡過白僵菌的桑葉后，其血淋巴上清的抑菌圈不明顯，因此本實驗后期采用簡單易操作的噴灑病原菌誘導家蠶蛹的方式提高蠶蛹體內抗菌肽的豐度。通過不同病原微生物誘導蠶蛹的血淋巴上清對三種水產養殖病原菌的抑菌結果可以看出，只有白僵菌誘導后抑菌效果相對穩定，這可能是由于不同微生物侵染蠶蛹的途徑不一樣，或者不同微生物誘導的抗菌肽成分不一樣，造成其對本研究所選用的三種水產病原菌的抑菌效果不明顯。

本研究明確了體外誘導家蠶蛹提高其血淋巴上清抑菌活性的方法，對家蠶蛹噴灑106CFU/L～107CFU/L的白僵菌，誘導2 d～3 d后蠶蛹的血淋巴抑制美人魚發光桿菌、維氏氣單胞菌及哈維氏弧菌等活性較高。后期可基于該研究結果，針對家蠶蛹的高值化利用問題進一步研究，如開發一種可以增強魚免疫力的飼料添加劑等。