魚類低值副產物制備抗菌肽研究進展

李海藍，陳亞楠，2，劉文博，3，趙青，2，廖濤，4，鉏曉艷，4*

（1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064；2.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430000；3.武漢工程大學化學與環境工程學院，湖北 武漢 430205；4.農業農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室，湖北 武漢 430000）

抗生素是20世紀最偉大的發現之一，但由于傳統抗生素的長期過量使用，使得耐藥變異菌株泛濫，對人類的健康造成一定的威脅。目前，抗菌肽被認為是最具有潛力代替抗生素的天然物質[1]，其作為具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽，由20～50 個氨基酸殘基組成，且通常富含陽離子，具有兩親性，廣泛分布于動物、植物與微生物中，如天蠶[1]、綿羊[2]、林蛙[3]、虹鱒魚[4]、豇豆[5]、乳酸鏈球菌[6]等，在它們的宿主先天防御功能中起到重要的作用[7]。其中，種類繁多的魚類是抗菌肽的重要來源，同時，魚類來源抗菌肽也有一些獨有的特性，它即使在非常高的鹽濃度下也能發揮作用，這成為開發治療性抗菌劑的良好潛在靶點[8]。

近年來，隨著國內外魚類加工技術的不斷進步，魚類加工產業也處在持續發展階段。但對于一些低值魚類，其雖然具有體型小、營養豐富、種類繁多及產量大的優點，但卻因為其加工產業鏈短，經濟效益低而造成了資源浪費[9]。同時，魚類在加工過程會產生大量的低值副產物，如魚頭、魚骨、魚皮、魚鱗、魚內臟等，占原料魚體質量的30%～50%[10]。這些副產物一直沒有被高效利用，它們大部分被浪費丟棄，或者用于生產一些低附加值產品，如飼料魚粉[11]。然而，近年來，這些副產物逐漸被用于生產一些蛋白質水解物和生物活性肽[9，12-15]，抗菌肽作為其中的一種生物活性肽，因在食品及醫藥領域具有良好的應用前景，而受到越來越多研究者的關注[7]。

目前，大量研究者開始在魚類低值副產物中尋找潛在的抗菌肽，這些抗菌肽可能在其母體蛋白質序列中并不活躍，因此需要合適的方法將其釋放出來[16-19]。總體來說，生產抗菌肽的傳統方法包括化學水解法（酸或堿水解）[20]、酶水解法[21]和微生物發酵法[22-24]。然而，由于化學水解法會引入一些有毒的化學品，所以酶水解法和微生物發酵法是生產抗菌肽最廣泛使用的方法[25]。同時，一些新興的新技術，如脈沖電場和亞臨界水萃取法，也逐漸被用來生產一些生物活性肽，以提高生物活性成分的產率[26]。

然而從魚類低值副產物中生產抗菌肽的研究相對較少，也不夠深入，大多研究僅停留在提取分離階段，只對微生物的活性進行評價。因此，本文主要綜述魚類低值副產物中抗菌肽的來源、制備方法以及對其抗菌活性的評價方法，旨在為魚類低值副產物中抗菌肽的制備生產提供理論參考，并促進對抗菌肽的研究，增加其利用價值。

1 抗菌肽主要來源

抗菌肽可能存在于魚類的多個部位，如器官、黏液、血液或組織中[8]，然而在魚類加工副產物中，抗菌肽的提取原料大多來源于內臟和魚皮，僅有較少研究從魚鱗和魚骨中提取抗菌肽（見表1）。

表1 抗菌肽的來源和制備方法以及抗菌活性檢測方法Table 1 Sources and preparation methods of antimicrobial peptides and detection methods of antibacterial activity

1.1 魚鱗

魚鱗是對魚體具有重要保護作用的結構，其主要由羥基磷灰石與膠原蛋白組成，其蛋白質含量約占總量的50%[43]。由于魚鱗中存在豐富的膠原蛋白，大多數研究者使用酸提法或者蛋白酶水解法處理魚鱗，以從魚鱗中提取膠原蛋白肽[44]與抗氧化肽[12]，有研究者使用胃蛋白酶水解鯽魚魚鱗，并通過凝膠過濾層析與陰離子交換層析進行分離純化，得到了對多種致病菌具有良好抗菌活性的抗菌肽[35]。目前，更多的研究是將從魚鱗中提取的膠原蛋白或羥基磷灰石與某些抗菌活性材料復合，從而有效提升其抗菌性能[45-46]。Kulkarni 等[47]將麥瑞加拉鯪魚魚鱗中提取的膠原蛋白與殼聚糖共混制備出了具有抗菌功效的新型生物降解膜。

1.2 魚骨

鈣和骨膠原蛋白是魚骨中的主要組成部分，其蛋白質含量約占總量的15%[48]。灰分是魚骨中含量最高的成分，其主要成分是鈣，主要以羥基磷灰石結晶的形式存在，鈣磷比為1.67[49]。有研究表明，從魚骨和魚鱗中提取的羥基磷灰石均具有抗菌活性，而魚骨中的羥基磷灰石抗菌活性更好。目前很少有研究從魚骨中提取抗菌肽，僅有Ren 等[36]使用胃蛋白酶酶解斑點叉尾鮰（Ictaluruspunctatus）魚骨，并通過響應面法對水解條件進行優化，最后得到了對大腸桿菌具有較好抗菌活性的抗菌肽，其抑菌圈直徑達到19.8 mm。

1.3 魚皮

魚皮占魚類總質量的8%～10%，其總蛋白質含量占20%以上，主要為膠原蛋白[50]。和魚鱗相同，大多數研究關注魚皮中膠原蛋白的提取及生物活性分析。然而，由皮細胞和表皮杯狀細胞分泌的表皮黏液也是魚皮的重要成分，也是先天免疫系統的重要組成部分，其也可能作為豐富抗菌肽的重要來源[51]。表皮黏液中的抗菌肽的主要提取方法為化學法和蛋白酶酶解法，經凝膠過濾或離子交換、反相色譜進一步純化后，可以得到對腐敗希瓦氏菌和黃體微球菌等微生物具有抑制作用的抗菌肽[38，41]。

1.4 魚內臟

內臟是魚類低值副產物含量最高的，占魚體總質量的12%～18%[52]。內臟中含有魚鰾、魚腸、精巢組織、魚子與魚油等，其是豐富的蛋白質來源，不僅可以用作動物飼料，而且可以作為生產脂肪酶與蛋白酶的原料[52]。關于從魚類內臟中提取抗菌肽的研究較多，主要采用蛋白酶酶解與發酵法提取，Pezeshk 等[29]發現從黃鰭金槍魚（Thunnusalbacores）內臟水解物中分離得到抗菌肽，可抑制魚類腐敗菌的生長。Ennaas 等[28]使用不同種類的商業酶水解大西洋鯖魚（Scomberscombrus）的內臟，發現其粗水解產物對單增李斯特菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用，同時，經過純化后的組分可完全抑制上述2 種微生物的生長。

2 抗菌肽的提取與純化

從魚類低值副產物中提取抗菌肽的傳統方法有化學水解（酸或堿水解）、酶水解、微生物發酵，雖然其都能有效促進抗菌肽的生產，但其各自都有優缺點，總結見表2。

表2 抗菌肽及生物活性肽的提取方法Table 2 Extraction methods of antimicrobial peptides and bioactive peptides

化學水解是通過使用酸或堿來切割肽鍵以產生多肽與游離氨基酸，雖然其價格低廉，操作簡單，但是難以控制的水解過程，以及易破壞多肽結構與生物活性的缺點限制了其進一步的應用[20]。

酶水解是利用蛋白酶直接水解魚類低值副產物來生產生物活性肽，由于其安全性高，水解條件溫和，并且可以有針對性地以低成本生產特定的肽，成為使用最廣泛的水解方法[19]。Robert 等[30]使用芽孢桿菌蛋白合物在50 ℃下水解羅非魚（Oreochromisniloticus）副產物（頭部、框架和內臟）30 min，發現其水解產物主要由多肽（46.9%）和寡肽（35.8%）組成，并對魯氏耶爾森菌具有抗菌活性。由于選用來自微生物的蛋白酶制劑使得水解過程具有較高的成本[53]，因此Wald 等[31]通過使用從虹鱒魚胃中分離純化得到的胃蛋白酶水解虹鱒魚的內臟，在37 ℃、pH2.0 的條件下進行水解，發現其水解產物對幾種革蘭氏陽性與陰性細菌皆有抗菌活性，且水解度對抗菌活性有很大的影響。

微生物發酵法是指利用產蛋白酶微生物發酵酶解魚類低值副產物，其安全、環保、經濟，是生產生物活性肽的另一種有效方法[25，54-55]。Song 等[42]通過混合微生物（施氏假單胞菌、漠海威芽孢桿菌、黑曲霉等）發酵棘頭黃魚（Collichthyslucidus）的副產物（內臟、頭、尾和骨骼），并從其發酵產物中分離純化出具有抗真菌活性的多肽，其可抑制植物病原菌的鼠疫菌屬的生長。與酶水解相比，微生物發酵法由于多肽產量低以及多肽形成缺乏特異性，使得在工業上的開發受到阻礙[56]。

除了上述傳統的方法，目前也有一些新的加工方法替代它們，如脈沖電場[57]與亞臨界水萃取法[26，58]。脈沖電場是一種新型的非熱技術，采用高強度脈沖電場通過去折疊、變性或凝膠化促進潛在生物活性肽的產生[26]。Franco 等[57]采用脈沖電場從鯛魚與鱸魚的副產物（魚頭、骨骼和鰓）中提取抗氧化劑，發現脈沖電場輔助水提取提高了提取物的抗氧化能力。亞臨界水萃取被認為是一種很有前途的創新技術，是通過利用溫度在100～374 ℃之間，壓力低于22 MPa（低于水的臨界點）的亞臨界水水解蛋白質，其在較短的時間內以與酶水解相當的效率水解蛋白質[26，59]。Uddin 等[60]利用亞臨界水萃取方法水解魷魚內臟，回收得到了一些有價值的產物，如氨基酸與還原糖。

經不同水解方法提取得到的一般為粗產物，需要進一步分離純化。通常，首先通過膜過濾對水解產物進行初始分離，之后采用色譜方法進一步分離純化，如尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法和反相高效液相色譜法[20]。研究發現通過膜超濾分離的黃鰭金槍魚（Thunnusalb-acores）內臟水解液，其最低分子量（＜3 kDa）組分對單增李斯特菌具有更強的抗菌活性[29]。

3 抗菌活性檢測方法

經提取、分離純化后得到的多肽需進一步驗證其抗菌活性，其主要評價方法有瓊脂擴散試驗（圓盤擴散分析）[36]、活細胞計數[27]、肉湯微量稀釋[29]、高通量熒光篩選[61]，其各有優缺點，總結見表3。

表3 抗菌活性檢測方法的優缺點Table 3 Advantages and disadvantages of detection methods of antibacterial activity

瓊脂擴散試驗與肉湯微量稀釋法因具有簡單方便的優點，是抗菌活性研究中常用的方法[62]。Ren 等[36]使用肉湯微量稀釋法研究斑點叉尾鮰魚骨蛋白酶解產物抗菌活性，結果發現鯰魚骨酶解物對大腸桿菌的最小抑制濃度為6 mg/mL，并通過原子力顯微鏡與透射電鏡發現其可通過損傷大腸桿菌細胞膜，導致細胞內容物的外泄，從而抑制并殺死大腸桿菌。由于部分真菌中菌絲體的存在，肉湯微量稀釋法可能不太適用于對真菌的抗菌活性檢測，而瓊脂擴散試驗相比肉湯微量稀釋法更具適用性，且更直觀。Song 等[42]利用瓊脂擴散試驗檢測抗菌肽對鼠疫菌屬抑制活性，發現在24.62 mg/mL 時即可形成明顯的抑制圈。與活細胞計數相比，瓊脂擴散試驗是一種更為直觀的抗菌活性檢測方法，雖然操作簡單，但其誤差較大。Cheng 等[27]使用活細胞計數法檢測了鮭魚精蛋白對煙熏鮭魚中單增李斯特氏菌的抑制活性，發現其在5 mg/g 濃度下即可延緩單增李斯特氏菌在煙熏鮭魚上的生長。高通量熒光篩選法是一種快速且具有成本效益的熒光方法，Kodedová 等[61]利用其檢測抗菌肽對念珠菌質膜的損傷，發現抗菌肽能夠在15 min 內以較低濃度殺死細胞。

4 抗菌機制

抗菌肽是魚類為抵御眾多微生物感染的重要防御機制，雖然其結構具有多樣性，但在本質上具有一定的共性[8]，如魚皮中產生的Cathelicidins，具有典型的整體陽離子和兩親性的結構特性[63]；以及可能來源于魚類各組織中的組蛋白衍生肽，其含有豐富的陽離子，同時具有α-螺旋與無規卷曲結構[64]；也還有一些未被深入研究的多肽，如從棘頭黃魚組織中得到的抗菌肽（氨基酸序列TFNTPAMYVAIQAVLSLYASGR），其可以抑制抗真菌的生長，被推測具有α-螺旋結構，C 端存在帶正電荷的殘基R，可能有助于通過靜電相互作用與真菌細胞膜相互作用[42]。同時，魚類中富含天冬氨酸和谷氨酸的一些非陽離子抗菌肽也相繼被發現[65]。總體來說，抗菌肽的作用機制主要分為兩種，一種為膜破壞機制，它們以特定的方式與帶電的細胞膜結合，從而穿透膜或形成孔，最終導致微生物因細胞內容物的泄露而死亡，主要存在3 種模型解釋這種作用機制，即桶柵模型、環孔模型和地毯模型[66]；另外一種是非膜破壞機制，它們可以通過跨膜易位后抑制重要的細胞過程，如核酸、蛋白質、肽聚糖的生物合成，從而起到殺死微生物細胞的作用[65]。目前，魚源抗菌肽的抗菌機制研究更多的是其對細胞膜的作用[67]，如具有疏水或兩親性α-螺旋結構的Piscidins，是通過典型的環孔模型與細胞膜作用而發揮抑菌作用[68]。總之，與抗生素相比，抗菌肽能夠極大程度地降低細菌耐藥性的概率，同時，由于魚類比哺乳動物更依賴其先天免疫防御，因此其也更有可能是對抗哺乳動物病毒感染的抗病毒化合物的潛在豐富來源[51]。

5 展望

魚類低值副產物的高值化利用一直是近年來關注的熱點，其富含各類蛋白質，是生產功能性生物活性肽的優質來源。然而，利用魚類低值副產物生產抗菌肽的研究不夠廣泛與深入，需要克服以下困難與挑戰。

第一，雖然魚類低值副產物占比較高，但生產抗菌肽的來源較少，主要來源為魚類內臟與魚皮，而魚鱗、魚骨相對較少，其中的一個重要的原因是大多研究者關注從魚鱗、魚骨中提取膠原蛋白與抗氧化肽，而忽略了抗菌肽的存在。因此，需要更多的研究者對其進行深入的研究。

第二，利用魚類低值副產物制備抗菌肽的方法多種多樣，雖然一些方法已被廣泛研究與應用，但在工業生產上耗時且昂貴，且其生物活性可能會受到很多因素的影響，因此需要結合現代加工工藝開發一種操作簡便、成本可控的規模化生產技術。

第三，從魚類低值副產物中提取的抗菌肽雖然能被證明其具有對某種微生物的抗菌活性，但關于抗菌肽的結構與功能之間的關系研究較少，同時，對其毒性研究也較少，因此需要更關注抗菌肽的抑菌機制并評估其在臨床實驗中的功效影響。