氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合氣味活度值分析紅花椒油的關(guān)鍵香氣物質(zhì)特征

高露,趙鐳,史波林,汪厚銀,鐘葵*,閆師杰

1(天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津,300392) 2(中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院農(nóng)業(yè)食品標(biāo)準(zhǔn)化研究所,北京,102200)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)是一種蕓香科(Rutaceae)植物[1],主要分為青花椒和紅花椒兩大品種。因其具有食藥兩用的功效,被廣泛用于烹飪調(diào)料和中藥配料[2]。中國(guó)是世界花椒第一生產(chǎn)大國(guó),具有豐富的資源[3-4],種植歷史非常悠久。

花椒通常被加工成花椒油進(jìn)行市場(chǎng)銷售,一定程度上減少了花椒加工及貯藏過(guò)程中香氣成分逸散,能夠較好地避免花椒香氣逸散導(dǎo)致品質(zhì)下降的問(wèn)題。現(xiàn)代儀器分析技術(shù)為花椒油關(guān)鍵香氣成分解析和研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考和技術(shù)支持。陳麗蘭等[5]采用GC-MS等技術(shù),鑒定出14種不同花椒油中芳樟醇、乙酸芳樟酯、苯乙酸甲酯、γ-松油烯、水芹烯等為關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。倪瑞潔等[6]通過(guò)氣相離子遷移譜聯(lián)用儀(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)技術(shù)測(cè)定發(fā)現(xiàn)芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯、檸檬烯等為韓城大紅袍花椒的標(biāo)志性差異物。SUN等[7]采用GC-MS技術(shù)鑒定芳樟醇、檸檬烯和乙酸芳樟酯等為花椒油中存在的主要香氣活性物質(zhì),研究認(rèn)為p-傘花烴、β-水芹烯、辛酸、香茅醇、乙酸辛酯和檜烯為關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。

近年來(lái)我國(guó)花椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,花椒調(diào)味油類產(chǎn)品產(chǎn)量及銷售大幅提升,市場(chǎng)產(chǎn)品品牌繁多,產(chǎn)品的質(zhì)量差異較大。為了豐富市售花椒油香氣特征的研究,目前,關(guān)于花椒油的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在實(shí)驗(yàn)室研究方面,而對(duì)市售花椒油的香氣特征研究較少。花椒油質(zhì)量的高低很大程度上取決于花椒香氣物質(zhì)種類以及含量,也是不同種類花椒油產(chǎn)品的關(guān)鍵品質(zhì)差異因素[8],開(kāi)展市售紅花椒油產(chǎn)品的香氣特征研究,對(duì)于市面上花椒油類產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)和品質(zhì)提升具有理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒油樣品均為市場(chǎng)銷售,根據(jù)紅花椒油品牌市場(chǎng)占有率的調(diào)研結(jié)果,共篩選出12個(gè)紅花椒油產(chǎn)品,產(chǎn)品品牌及原料信息如表1所示。大部分市售花椒油產(chǎn)品使用了四川花椒原料,原料油種類以菜籽油和植物油為主。1,2-二氯苯,上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

表1 紅花椒油樣品信息Table 1 Red Chinese pepper oil sample information

1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02電子天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司;7890A-5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)Agilent科技公司;HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),四川漢源;固相微萃取進(jìn)樣針萃取頭[DVB/CAR/PDMS)50/30 μm],美國(guó)SUPELCO公司;PC-420D磁力加熱攪拌器,美國(guó)Corning公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

用電子天平準(zhǔn)確稱取紅花椒油樣品5.00 g,加入1 μL質(zhì)量濃度為0.326 5 μg/μL的1,2-二氯苯溶液,置于20 mL頂空瓶中,并立即加蓋密封,在65 ℃的溫度下,恒溫水浴20 min,接著在萃取30 min后,再將萃取頭插入GC進(jìn)樣口進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為15 min的解吸附,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次[9]。

1.3.2 GC-MS檢測(cè)參數(shù)及程序

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)條件:萃取溫度設(shè)置為恒定的65 ℃,水浴平衡時(shí)間設(shè)置為20 min,萃取時(shí)間保持30 min。

GC條件:進(jìn)樣口的溫度設(shè)置為250 ℃,色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 mm);柱溫設(shè)置為65 ℃,采用分流比20∶1進(jìn)樣;吹掃流量為1.5 mL/min。具體程序的升溫條件:以25 ℃/min的速度升至90 ℃,保持1 min,以1 ℃/min升至105 ℃,保持2 min,以3 ℃/min至200 ℃,保持2 min,以30 ℃/min至250 ℃,保持2 min;

MS條件:檢測(cè)器溫度設(shè)置為230 ℃;傳輸線溫度為280 ℃;質(zhì)量范圍為35～500 amu。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 GC-MS定性定量分析

通過(guò)對(duì)NIST14.0數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及保留指數(shù)(retention index,RI)[10]的對(duì)比鑒定,化合物含量通過(guò)峰面積歸一法進(jìn)行分析,保留指數(shù)的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.4.2 氣味活度值(odor activity value, OAV)的計(jì)算

OAV可判斷不同化合物在食品香氣中的貢獻(xiàn)度,通過(guò)風(fēng)味物質(zhì)的含量與其嗅覺(jué)閾值的比值計(jì)算得到[11],具體計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:Ci為化合物的含量,mg/kg;OTi為嗅覺(jué)閾值,mg/kg。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,SIMCA-P 11.5、Origin 8.0以及SPSS 19.0軟件完成數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花椒油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

采用GC-MS技術(shù)對(duì)紅花椒油揮發(fā)性物質(zhì)成分進(jìn)行分析,12種市售紅花椒油揮發(fā)性化合物的種類及含量均存在顯著差異(P<0.05)。紅花椒油揮發(fā)性風(fēng)味成分總含量為757.2～3 132.79 mg/kg,共檢出85種揮發(fā)性風(fēng)味成分,烯烴類物質(zhì)最多,有25種;醛類物質(zhì)19種;醇類物質(zhì)14種;酯類物質(zhì)12種;酮類物質(zhì)6種;其他類7種;酸類物質(zhì)最少,僅有2種。熱圖將GC-MS分析得到的揮發(fā)性物質(zhì)成分?jǐn)?shù)據(jù)可視化處理,顏色由藍(lán)色到紅色代表化合物含量依次增加。圖1表明揮發(fā)性物質(zhì)成分中,烯烴類含量最高,主要揮發(fā)性物質(zhì)有乙酸芳樟酯、檜烯、芳樟醇、月桂烯、檸檬烯、羅勒烯等。與高夏潔等[12]報(bào)道的高溫制取紅花椒油中特征香氣物質(zhì)為月桂烯、芳樟醇、桉葉油醇、檸檬烯、乙酸芳樟酯及ISELI等[13]報(bào)道的花椒中關(guān)鍵差異性物質(zhì)為檸檬烯、乙酸芳樟酯、β-月桂烯、檜烯、芳樟醇等研究結(jié)果基本一致。

圖1 紅花椒油GC-MS測(cè)定結(jié)果熱圖Fig.1 Volatile compositions heatmap of red Chinese pepper oil products measured by GC-MS

2.2 花椒油活性香氣值分析

OAV對(duì)于食品香氣研究具有重要的作用,通常以濃度和閾值2個(gè)維度來(lái)評(píng)價(jià)食品中揮發(fā)性物質(zhì)在食品中的影響[14-15]。通常,OAV>1的香氣化合物被認(rèn)為對(duì)產(chǎn)品整體香氣影響較大,其數(shù)值越大表明對(duì)香氣影響越大[16]。查閱文獻(xiàn)獲取紅花椒油中OAV>1的香氣物質(zhì)共計(jì)31種,香氣物質(zhì)的閾值、香氣描述及OAV如表2所示。

表2 不同市售紅花椒油特征香氣物質(zhì)閾值、香氣描述及OAVTable 2 Aroma substance threshold, aroma description, and OAV of different commercially available red Chinese pepper oil

由表2可知,12個(gè)花椒油中有10種共有的活性香氣物質(zhì),9個(gè)花椒油中共有的活性香氣物質(zhì)共計(jì)16種。其中,2-庚烯醛、月桂烯、芳樟醇、羅勒烯、檸檬烯5種香氣物質(zhì)在大部分花椒油樣品中OAV≥1 000,特別是芳樟醇、月桂烯等物質(zhì),在部分花椒油中的活性值達(dá)到近3萬(wàn)。乙酸芳樟酯、正辛醛、反式-2,4-癸二烯醛、α-水芹烯、R-(-)-香芹酮這5種香氣物質(zhì)在大部分花椒油樣品中OAV范圍為100

聚類分析可以根據(jù)樣本數(shù)據(jù)特征進(jìn)行分類,將相似度較高樣品聚為一類[18],對(duì)12種紅花椒油OAV通過(guò)系統(tǒng)聚類的方法進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)設(shè)定距離為10時(shí),12種紅花椒油分為了三大類。其中,麻得倒、萬(wàn)弗、友加、建華、山之?huà)伞⑽遑S黎紅(H1～H6)聚為一類;樹(shù)上鮮、帥青(H7～H8)聚為一類;愛(ài)蜀味、蜀味坊、新黎紅、長(zhǎng)康(H9～H12)為一類。

圖2 紅花椒油OAV系統(tǒng)聚類分析Fig.2 Cluster analysis of red Chinese pepper oil OAV system

2.3 紅花椒油OAV的偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)分析

聚類分析屬于無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)算法,主要用來(lái)說(shuō)明樣品的分類趨勢(shì),不易準(zhǔn)確獲取不同類別樣品間的差異來(lái)源[19]。PLS-DA是有監(jiān)督學(xué)習(xí)算法,可以實(shí)現(xiàn)樣品間的類別預(yù)測(cè),消除組內(nèi)噪音,突出組間差異[20],但過(guò)擬合現(xiàn)象的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果的差異,因此,需要置換檢驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證模型參數(shù)[21],如圖3所示。

a-PLS-DA的模型參數(shù);b-模型檢驗(yàn)結(jié)果圖3 PLS-DA模型參數(shù)Fig.3 Replacement test of PLS-DA model parameters

變量重要性投影值(variable importance in project,VIP)通常用于PLS-DA模型中變量重要程度的評(píng)價(jià)。VIP值越高,表明該香氣物質(zhì)在花椒油樣品類型判別和差異分析中越重要[20]。一般認(rèn)為VIP>1.0的變量對(duì)樣品的區(qū)分具有較高的貢獻(xiàn)率。

由圖4可知,有12種香氣化合物的VIP>1,可以作為判別三類紅花椒油特性香氣化合物。分別為:正辛醛(G13)、芳樟醇(G1)、檸檬烯(G25)、檜烯(G21)、β-蒎烯(G22)、月桂烯(G23)、2-壬烯醛(G17)、己醛(G11)、羅勒烯(G26)、(Z)-芳樟醇氧化物(G31)、戊醛(G10)和乙酸異丁酯(G5)。

圖4 紅花椒油樣品PLS-DA的VIPFig.4 VIP of PLS-DA of red Chinese pepper oil samples

Biplot圖將得分圖和載荷圖結(jié)合在一起,可以說(shuō)明每個(gè)變量在判別組間差異中的影響。以第一主成分為橫坐標(biāo),第二主成分為縱坐標(biāo)建立紅花椒油和香氣化合物相關(guān)性的Biplot圖(圖5)。

圖5 不同紅花椒油中揮發(fā)性香氣成分的PLD-DA結(jié)果Fig.5 PLD-DA results of volatile aroma components in different red Chinese pepper oil注:G1-G31:香氣化合物;H1-H12:12種紅花椒油樣品; 紫色為VIP>1的關(guān)鍵香氣化合物。

由圖5分析可知,樹(shù)上鮮、帥青(H7～H8)紅花椒油以月桂烯(G23)、羅勒烯(G26)、檸檬烯(G25)為主要關(guān)鍵差異性化合物,結(jié)合表2可知,月桂烯香氣為花香,羅勒烯具有甜香,檸檬烯香氣為柑橘香,乙酸異丁酯具有月季花香和水果香,正辛醛香氣描述為香草味、橘子味,但此類樣品與乙酸異丁酯(G5),正辛醛(G13)距離較遠(yuǎn),因此,這類紅花椒油主要表現(xiàn)為花香,柑橘香和甜香香氣特征,具有較弱的水果香和香草味;芳樟醇(G1)、檜烯(G21)、β-蒎烯(G22)、(Z)-芳樟醇氧化物(G31)是愛(ài)蜀味、蜀味坊、新黎紅、長(zhǎng)康(H9～H12)這一類紅花椒油的關(guān)鍵差異性化合物,結(jié)合表2可知,芳樟醇香氣描述為花香、青香、木香、甜香,β-蒎烯香氣描述為松木香、樹(shù)脂香,檜烯香氣描述為松節(jié)油,(Z)-芳樟醇氧化物香氣描述為花香,因此,此類樣品香氣特點(diǎn)可描述為花香、青草香、松木香及樹(shù)脂香;麻得倒、萬(wàn)弗、友加、建華、山之?huà)伞⑽遑S黎紅(H1～H6)這一類紅花椒油相對(duì)樹(shù)上鮮、帥青(H7～H8),愛(ài)蜀味、蜀味坊、新黎紅、長(zhǎng)康(H9～H12)這兩類紅花椒油中的關(guān)鍵差異性化合物距離較遠(yuǎn),表現(xiàn)出較弱的花香,水果香,青草香和松木香等香氣特征。這12種市售不同紅花椒油所用原料花椒產(chǎn)區(qū)基本為四川漢源,主體揮發(fā)性物質(zhì)也大體一致,但是由于關(guān)鍵差異性化合物的不同會(huì)對(duì)樣品分類產(chǎn)生影響,呈現(xiàn)不同香氣特征。郝旭東等[23]對(duì)4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)大紅袍花椒的揮發(fā)性組分分析中,關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)為芳樟醇、3-蒈烯、乙酸香葉酯和月桂烯,對(duì)大紅袍花椒整體香氣有較大貢獻(xiàn)度,與本研究結(jié)果基本一致。蒲鳳琳等[24]研究中發(fā)現(xiàn)月桂烯、檸檬烯、β-羅勒烯是四川漢源花椒的特征風(fēng)味成分,與本研究結(jié)果一致。雖然市售不同花椒油原料產(chǎn)地相同,但是由于關(guān)鍵差異性物質(zhì)的不同表現(xiàn)不同香氣特征,對(duì)于不同紅花椒油的關(guān)鍵香氣物質(zhì)差異及香氣描述還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文以12個(gè)市售紅花椒油為研究對(duì)象,采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定,分析共有85種揮發(fā)性物質(zhì),結(jié)合OAV值確定特征香氣成分有31種化合物。在對(duì)不同市售紅花椒油分類后,經(jīng)PLS-DA的VIP值對(duì)導(dǎo)致分類的關(guān)鍵差異性香氣成分進(jìn)行分析。以VIP>1進(jìn)行篩選,芳樟醇、正辛醛、月桂烯、(Z)-芳樟醇氧化物、檜烯、β-蒎烯、檸檬烯、2-壬烯醛、羅勒烯、己醛、戊醛和乙酸異丁酯為關(guān)鍵香氣物質(zhì)。本文探討了市售不同紅花椒油由于關(guān)鍵差異性物質(zhì)的不同,分成三大類,分別呈現(xiàn)不同的香氣特征,在一定程度上為建立紅花椒油香氣成分圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)特征香氣提供理論數(shù)據(jù)支持,對(duì)市售花椒油綜合加工開(kāi)發(fā)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。關(guān)于市售不同花椒油原料花椒產(chǎn)區(qū),原料油種類等對(duì)花椒油香氣類型差異的影響還有待進(jìn)一步研究。