堿性電解水提取對羊肚菌多糖性質及抗氧化活性的影響

宋光明,鄧玲,趙祎,曾云軍,劉杰,鐘耕,5*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(重慶醫藥高等?？茖W校,重慶,401334) 3(重慶市生物技術研究所有限責任公司,重慶,401121)4(重慶市糧油質量監督檢驗站,重慶,400040) 5(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室,重慶,400716)

羊肚菌(Morchella)屬子囊菌門羊肚菌科羊肚菌屬,其表面由不規則網格交叉形成蜂巢狀,整體酷似羊肚而得名[1]。羊肚菌在我國分布廣泛,近年來,由于人工栽培的成功,關于羊肚菌的研究越來越多。研究表明,羊肚菌富含礦物質、維生素和一些必需的生物大分子,如多糖、蛋白質等,具有顯著的藥用和生物學特性[2]。羊肚菌多糖(Morchellapolysaccharide, MEP)是子實體中含量最豐富的成分之一,也是主要活性物質,PAN等[3]發現羊肚菌多糖羊肚菌多糖(Morchellaimportunapolysaccharide, MIP)可以通過調節糖尿病小鼠腸道微生物豐度來改善糖尿病引起的腸道疾病,并且MIP干預后小鼠肝臟代謝物紊亂也得到改善;ZHANG等[4]發現羊肚菌多糖羊肚菌子實體多糖可作為免疫調節劑通過刺激巨噬細胞的免疫反應,減輕氯霉素誘導的斑馬魚免疫損傷;此外羊肚菌多糖還具有抗腫瘤、抗衰老等生物活性[5],因此羊肚菌多糖作為天然生物活性物質在生物醫藥、食品和保健品等領域具有較好的開發潛力和應用前景。

多糖的活性受其化學組成和空間構象影響,多糖結構和成分又因提取方法而異[6],因此高效提取羊肚菌多糖并維持生物活性,是充分利用羊肚菌多糖的重要前提。熱水提取是羊肚菌多糖提取最常用的方法,但是該方法提取時間長、提取得率較低,通常輔以酸、堿或超聲等物理化學方法。據趙炳杰等[7]報道,羊肚菌中含有較多蛋白結合多糖,通常采用堿法破壞細胞結構后與糖蛋白作用,使胞內不溶性多糖轉變為可溶性多糖提高得率;但是堿濃度需嚴格控制,濃度過低達不到提取效果,過高會導致多糖分子降解、活性降低[8]并且產生廢水污染環境。

電解飽和電解質生產的電解水,可以分為酸性電解水和堿性電解水,其中堿性電解水(alkaline electrolyzed water, AEW)是具有堿性特質、強滲透性的小分子水,可以破壞細胞膜并滲入,用于活性成分的提取,并且具有一定的負氧化還原電位(oxidation-reduction potential, ORP),作為溶劑在提取過程中可以保護活性基團[9]。提取后堿性電解水無需特殊處理,其活性成分可自然狀態下與光、活性氧等接觸逐漸分解,還原為普通水,對環境友好[10]。SOQUETTA等[11]用堿性電解水從柑桔皮中提取生物活性化合物,與純水相比多酚得率提高15.7%,黃酮得率提高21.6%,并可縮短提取時間;苗雨欣等[12]用堿性電解水替代同pH值堿水提取靈芝多糖,得率提高74.72%;LI等[13]用堿性電解水提杏蛋白,提取率提高了10.4%,且堿性電解水所提蛋白比堿水得蛋白表現出較好的起泡能力和乳液穩定性。

現有的研究多集中在如何利用電解水提高提取成分的提取率,對其影響提取成分的理化性質的研究很少,關于堿性電解水提取羊肚菌多糖的研究尚未見報道。本實驗以羊肚菌粉為原料,以堿性電解水為溶劑,提取羊肚菌子實體多糖,并以堿水和純水提取的多糖為對照,比較其結構和抗氧化活性方面差異,以期為羊肚菌多糖高效綠色提取和應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌,重慶市城口縣松坤菌草有限責任公司;葡萄糖、D-半乳糖醛酸等均為標準品,北京Solarbio試劑公司;木瓜蛋白酶、DPPH、ABTS、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolinone, PMP),天津市北辰區索羅門生物試劑銷售中心;其他試劑為分析純,重慶興光化玻公司。

1.2 儀器與設備

CJ120超微粉碎機,河南瀚華科技有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀,美國安捷倫公司;X射線衍射儀,遼寧通達科技有限公司;ALPH2-1/LD冷凍干燥機,珀金埃爾默公司;XK-A7電解水生成器,廣東新康公司;UV-759紫外分光光度計,成都析譜儀器有限公司;Spectrum100紅外光譜儀,珀金埃爾默公司;pH計,上海儀電科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 堿性電解水的制備

堿性電解水由多功能電解水制備器制備。電解槽陽極加入飽和KCl溶液,陰極接入純水,施加20 V電壓,電解一定時間測定得到pH值12的堿性電解水。

1.3.2 羊肚菌粗多糖的提取方法

將羊肚菌子實體烘干至恒重,經超微粉碎機粉碎過250目篩,得到均勻的粉末樣品。

1.3.2.1 純水提取法

根據前期預實驗結果,將樣品(5.0 g)用純水在指定的料液比(1∶30,g∶mL)、提取溫度(80 ℃)、提取時間(1 h)提取。提取液5 500 r/min離心12 min,上清液4倍體積無水乙醇4 ℃沉淀8 h,收集沉淀,冷凍干燥得到粗多糖。置于干燥、避光處保存。將純水提多糖命名為WE-MEP。

1.3.2.2 堿水提取法

將1.3.2.1節中純水替換為pH值12的KOH溶液,其余步驟相同。將堿水提多糖命名為AW-MEP。

1.3.2.3 堿性電解水提取法

將1.3.2.1節中純水替換為pH值12的堿性電解水,其余步驟相同。將堿性電解水提多糖命名為AEW-MEP。

1.3.3 多糖分離及初步純化

分離及純化參考ZHU等[14]的方法略作修改,采用酶法除蛋白,分別將多糖溶解配制成溶液,加入質量分數為3%木瓜蛋白酶(200 U/mg),55 ℃酶解35 min,滅酶、冷卻,加入體積分數為8%的H2O2溶液脫色,4 500 r/min離心13 min,除去沉淀。上清液用4倍體積無水乙醇4 ℃沉淀8 h,收集沉淀冷凍干燥,得到3種方法提取的初步純化羊肚菌多糖。

1.3.4 純度鑒定和分子質量測定

凝膠滲透色譜法測定多糖分子質量分布和純度,配制樣品液(2 mg/mL)過0.45 μm微孔濾膜進入系統。

使用Sepax SRT SEC-100(7.8 mm×300 mm)凝膠柱;流速1 mL/min,柱溫40 ℃;通過一系列不同分子質量(708、344、107、47、5 908 Da)標準聚鈉鹽(苯乙烯磺酸鈉)校準,根據保留時間計算待測多糖的分子質量。

1.3.5 純化多糖理化性質分析

1.3.5.1 純化多糖中總糖含量及提取率測定

采用苯酚-硫酸法測定糖含量,取10 mg純化多糖溶于10 mL純水配成溶液,取出1 mL加入1 mL體積分數為5%的苯酚、5 mL濃硫酸反應25 min,測定490 nm處吸光值。以葡萄糖標準溶液(0.1 mg/mL)繪制標準曲線計算樣品多糖質量,提取率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:m,測得多糖質量,g;c,稀釋倍數;M,樣品質量,g。

將上述溶液稀釋一定體積后,按同樣方法測定總糖含量,總糖含量的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:n,測得多糖質量,g;0.9,多糖校正系數;N,所取羊肚菌多糖質量,g。

1.3.5.2 蛋白含量測定

考馬斯亮藍法測定蛋白含量,參考ZHANG等[15]的方法略作修改,從1 mg/mL純化多糖溶液取1 mL上清液與5 mL考馬斯亮藍混合,反應7 min測定595 nm處吸光值。以牛血清蛋白標準溶液(0.1 mg/mL)繪制標準曲線計算蛋白含量。

1.3.5.3 糖醛酸含量測定

參考HUO等[16]的方法略作修改,從1 mg/mL純化多糖溶液取0.25 mL,加1.5 mL四硼酸鈉-濃硫酸溶液,沸水浴6 min,降至室溫加入3-苯基酚溶液25 μL,室溫反應15 min,測定520 nm處吸光值。以半乳糖醛酸溶液(0.1 mg/mL)繪制標準曲線計算糖醛酸含量。

1.3.6 單糖組成測定

單糖組成參考LI等[17]的方法略作修改,取10 mg純化多糖三氟乙酸水解2 h,取1 mL水解液加入1 mL甲醇搖勻,70 ℃水浴同時N2吹干;分別取0.5 mL樣品水解液與單糖標準溶液混合,加入0.5 mL的PMP-甲醇溶液混勻,70 ℃反應2 h,調節pH值至7.0±0.05,過0.22 μm水系膜進液相系統分析。

使用Agilent EC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),進樣量8 μL,流速0.8 mL/min,流動相A為25 mmol/L乙酸銨緩沖液,流動相B為乙腈,二者比例為80∶20。

1.3.7 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)檢測

將干燥預處理的羊肚菌多糖樣品3 mg置于壓片模具中,在400～4 000 cm-1波數范圍內以空氣為背景進行掃描。

1.3.8 X-射線衍射檢測

將干燥的羊肚菌多糖樣品均勻置于X射線衍射儀樣品池,測試條件為:X射線的波長λ=0.154 nm;管壓40 kV;掃描范圍(2θ)10～65 °,掃描速度5 °/min。

1.3.9 體外抗氧化活性測定

參考LI等[18]的方法略作修改,以抗壞血酸為標品,測定不同溶劑所得羊肚菌多糖對DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力及Fe3+還原力。

1.3.9.1 DPPH清除率測定

準確稱取DPPH用無水乙醇配制成濃度為0.2 mmol/L的溶液。配制不同質量濃度(2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL)的多糖樣品溶液與等體積DPPH混合,純水、乙醇做空白對照,搖勻后避光反應25 min,測吸光值,清除率的計算如公式(3)所示:

(3)

式中:A0,純水組吸光度;A1,乙醇組吸光度;A2,樣品吸光度。

1.3.9.2 Fe3+還原力測定

分別取0.50 mL不同質量濃度(2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL)的樣品,與等體積磷酸緩沖液(pH=6.6)、10 g/L鐵氰化鉀混合,50 ℃水浴25 min,冷卻至室溫,再加入1.00 mL 100 g/L三氯乙酸,混勻取1 mL上清液加入0.25 mL 1 g/L氯化鐵溶液,避光反應30 min,于700 nm測吸光度值。通過比較樣品和維生素C的吸光度,判斷多糖的還原能力。

1.3.9.3 ABTS陽離子自由基清除能力測定

配制ABTS溶液(7 mmol/L)和過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)等體積混合,4 ℃過夜放置,用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液調整其734 nm處吸光度為0.70±0.02。分別取1 mL不同質量濃度(2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL)的多糖樣品加入3 mL ABTS工作液,混合均勻,避光放置5 min,在波長734 nm處測定吸光度,清除率的計算如公式(4)所示:

(4)

式中:A0為純水組吸光度;A1為磷酸鹽緩沖液組吸光度;A2為樣品吸光度。

1.4 數據處理

所有結果均表示為平均值±標準差,使用SPSS 25通過Tukey檢驗分析結果,差異顯著性為P<0.05。采用OriginPro 2018軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取對羊肚菌多糖提取率的影響

分別采用純水提取、堿水提取、堿性電解水提取從羊肚菌中分離多糖,提取率如表1所示。堿性電解水提取法提取率為(7.12±0.33)%,顯著高于堿水法和純水法提取率[(6.65±0.27)%,(5.46±0.15)%,P<0.05]。這是因為堿性條件可以加速細胞壁破裂,釋放胞內多糖,羊肚菌含有較多糖蛋白,堿性條件使糖蛋白更好地轉化為可溶性多糖[7],因此AW-MEP與AEW-MEP有更高的提取率。但是與傳統堿水不同,堿性電解水是通過外加電場,破壞水分子氫鍵,形成由較少水分子組成的小水分子團簇,不會引入雜質,且含有較多OH-[19],作為溶劑不僅可以提供堿性環境而且較堿水制備簡單、綠色安全。

表1 多糖提取率及主要化學組成Table 1 Main compositions and yields of polysaccharide fractions

2.2 不同溶劑提取對羊肚菌多糖化學成分組成的影響

3種方法所得羊肚菌多糖中主要化學成分如表1所示,AEW-MEP中糖醛酸含量[(5.59±0.09)%]顯著高于WE-MEP和AW-MEP的糖醛酸含量[(3.92±0.17)%,(2.83±0.13)%,P<0.05];WE-MEP蛋白含量為(0.98±0.02)%,顯著低于其余2種方法,說明堿性條件下更多蛋白類物質被溶出;AEW-MEP總糖含量(75.11±1.14)%,顯著高于WE-MEP[(67.91±1.05)%]、AW-MEP[(71.01±2.62)%]。堿水在提取過程中會破壞鏈結構,斷裂形成的小分子糖需高濃度醇沉析出,因此AW-MEP總糖含量、提取率低于AEW-MEP。

LI等[20]采用亞臨界水、純水2種方法提取羊肚菌多糖,亞臨界水溶解能力更強,獲得更高的糖醛酸、蛋白質和脂肪含量,說明不同溶劑提取對多糖化學成分組成有顯著影響;本研究中堿性電解水是強滲透性的小分子水,多糖類物質分子中含有大量極性基團,對水分子具有較大親和力,多糖與小分子水締結,增加溶解度[10],并且堿性條件下酸性多糖更易溶出,堿性電解水所提多糖表現出更高的提取率和糖醛酸含量,其中多糖中的糖醛酸含量會影響抗氧化活性、降血糖活性、免疫活性等[21],因此AEW-MEP可能具有更好的生物活性。

2.3 不同溶劑提取對多糖基本性質的影響

2.3.1 分子質量分布

采用凝膠色譜法對羊肚菌多糖的分子質量進行測定,分子質量分布如表2所示。WE-MEP與AEW-MEP所得多糖均具有2種不同分子質量分布范圍,羊肚菌多糖WE-MEP平均分子質量分布為9.0×105、3.9×105Da,所占比例為22.84%、77.16%;羊肚菌多糖AEW-MEP平均分子質量分布為8.9×105、3.8×105Da,分別占23.93%、76.07%。而羊肚菌多糖AW-MEP具有3種分子質量分布范圍,分別為8.1×105、3.6×105、1.7×104Da,分別占比13.12%、72.9%、13.97%;羊肚菌多糖AW-MEP峰1和峰2平均分子質量分別顯著低于WE-MEP與AEW-MEP峰1和峰2平均分子質量,并且分散性較差,可能是在強堿性、加熱條件下導致糖苷鍵斷裂,產生小分子多糖,使得AW-MEP峰1、峰2面積占比明顯減小,產生的峰3是不規則斷裂后的小分子片段,分散度較差。

表2 多糖相對分子質量及其分布Table 2 Results of monosaccharide composition

與其他研究相比,YIN等[22]比較不同方法提取海帶多糖的影響,采用酸法輔助提取海帶多糖過程中糖苷鍵斷裂,多糖分子質量分布范圍更廣且較純水提取法低,而相同條件下酶法輔助提取不影響分子質量分布;在本實驗中堿水提取過程中可能會導致氧原子連接側鏈、β-(1→4)和β-(1→6)連接的部分殘基發生斷裂[7],使多糖分子質量分布更廣;堿性電解水中含有帶電離子和自由基團,具有一定負氧化還原電位(-900～-1 000 mV),可以保護多糖結構不被破壞[9],堿性電解水所提多糖,多分散系數更接近1,說明多糖分子聚合度高且分布集中,多糖結構保持較好,堿性電解水提取不會對多糖的分子質量分布造成顯著影響。

2.3.2 單糖組成分析

采用高效液相色譜法對羊肚菌單糖組成進行測定,與混合單糖標準品對照,結果如圖1所示,羊肚菌多糖WE-MEP、AW-MEP、AEW-MEP均由3種單糖組成,分別為甘露糖、葡萄糖、半乳糖,摩爾質量百分比分別為4.18%、54.77%、41.05%;3.87%、46.19%、49.94%;3.32%、56.03%、40.65%。單糖組成結果表明,羊肚菌多糖主要由葡萄糖和半乳糖組成,含有少量甘露糖;3種提取方法所得多糖在單糖組成種類上沒有顯著區別,在比例上AW-MEP與其他2種多糖具有顯著差異,有更高的半乳糖比例,較低的葡萄糖比例;造成差異的原因可能是多糖分子在提取過程中受高溫、堿性條件影響部分降解,導致單糖組成比例不同[6]。

Man-甘露糖;Rib-核糖;Rha-鼠李糖;Xyl-木糖; Glc-葡萄糖;Gal-半乳糖 a-單糖混標;b-3種多糖樣品圖1 單糖組成結果Fig.1 Results of monosaccharide composition

ZHANG等[23]采用深共熔溶劑提取香菇多糖,與純水提取所得多糖的單糖組成種類相同,在比例上具有顯著差異,說明不同的方法可能改變所提取多糖的基本結構,并可能影響多糖的活性。結合本實驗分子量分析結果,與純水提取法相比,堿水提取會改變多糖分子鏈結構進而影響單糖組成比例,堿性電解水提取法對多糖的基本結構無顯著影響,因此不影響其單糖組成種類及比例。

2.3.3 紅外光譜分析

圖2 羊肚菌多糖的紅外吸收光譜Fig.2 The FT-IR spectra of MEPs

2.3.4 X-射線衍射分析

3種多糖在10～30 °均出現峰寬較寬、強度較大的衍射峰,表明MEP內部結晶度較低不能形成單晶體,而是以非晶體形式存在,符合真菌多糖結晶特性[27]。LI等[28]采用純水提取、酶輔助提取、超聲提取、微波提取4種方法提取元菇多糖,4種多糖X射線衍射曲線均呈面包狀,沒有尖峰,說明提取方法不會影響多糖的結晶性。堿性電解水所提多糖在2θ為5～60 °內,與純水提取法所得多糖相比,X射線衍射曲線無顯著區別,未出現尖銳的小峰,這說明堿性電解水提取不會改變羊肚菌多糖結晶性。具體見圖3。

圖3 多糖的X衍射圖Fig.3 X-ray diffraction histogram of MEPs

2.4 抗氧化活性測定結果

2.4.1 DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力分析

DPPH自由基清除率如圖4-a所示,3種方法所得多糖均具有一定的自由基清除能力并且在一定濃度范圍內清除率隨質量濃度的增大而增加,在質量濃度高于1.0 mg/mL后,各質量濃度AEW-MEP的DPPH清除率顯著高于WE-MEP(P<0.05),相同質量濃度下,AW-MEP清除率始終顯著低于另外兩者(P<0.05);在質量濃度2.5 mg/mL時,AEW-MEP自由基清除率達到83.12%。經計算AEW-MEP、WE-MEP與AE-MEP的IC50分別為0.125 8、0.129 1、0.137 9 mg/mL,總體上AEW-MEP的DPPH自由基清除能力強于WE-MEP和AE-MEP。

a-DPPH自由基清除率;b-ABTS陽離子自由基清除率;c-Fe3+還原力圖4 三種方法提取所得羊肚菌多糖DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率、Fe3+還原力比較Fig.4 The in vitro antioxidant activities of MEPs extracted with three solvents

ABTS陽離子自由基清除率如圖4-b所示,3種方法所得多糖對ABTS陽離子自由基的清除率隨質量濃度的增加而上升,質量濃度低于1 mg/mL時WE-MEP和AEW-MEP各濃度還原能力相近;質量濃度高于1 mg/mL后AEW-MEP清除率明顯升高;在2.5 mg/mL時AEW-MEP的自由基清除率達到77.95%,高于WE-MEP清除率72.12%,較AE-MEP高15.62%。經計算AEW-MEP的IC50值為1.637 mg/mL顯著低于WE-MEP與AE-MEP的IC50值,分別為1.919 4、2.343 8 mg/mL(P<0.05),因此ABTS陽離子自由基清除能力:AEW-MEP>WE-MEP>AE-MEP。

自由基由在人體內積累會引發如動脈粥樣硬化、心臟病、抑郁癥等慢性疾病[29]。多糖作為能清除自由基且安全、健康的天然抗氧化劑,受到人們廣泛關注。FU等[30]的研究表明,多糖對自由基清除能力與多糖支鏈上的基團、糖醛酸含量和葡萄糖含量有關,結合單糖組成和化學成分結果,AEW-MEP與WE-MEP較AW-MEP有更高的糖醛酸和葡萄糖含量,并且堿性電解水具有氧化還原電位,提取過程可以對多糖支鏈上的羰基、醛基起保護作用,而堿水提取過程中可能破壞多糖結構,影響生物活性,因此可能是AEW-MEP具有更高的清除率,AW-MEP清除率最低的原因。

2.4.2 Fe3+還原力分析

Fe3+還原力測定結果如圖4-c所示,3種方法所得羊肚菌多糖均具有一定的Fe3+還原能力且多糖還原能力隨質量濃度的增加而上升,在質量濃度超過1.5 mg/mL后還原能力隨質量濃度增加的遞增趨勢逐漸變緩,在2.5 mg/mL時還原力達到最高,此時AEW-MEP還原力較AE-MEP高0.179 mmol/L。總體上相同質量濃度下的Fe3+還原能力:AEW-MEP>WE-MEP>AE-MEP。

由于糖醛酸中羧基與離子形成交聯[21],從而多糖表現出對金屬離子的還原能力;結合糖醛酸測定結果AE-MEP中糖醛酸含量較低,這可能是導致其活性較低的原因。

3 結論

本研究發現,純水提取法對多糖結構和功能影響較小,但得率較低;堿水提取法可提高多糖得率,但會改變分子質量分布和單糖組成比例,進而影響多糖抗氧化活性;堿性電解水法提取羊肚菌多糖得率較純水法提高42.4%,并且提取過程不影響其分子質量分布,不改變基團結構,不影響結晶性,并且所得多糖具有更好的抗氧化能力。此外堿性電解水制備簡單、提取過程對環境友好,可作為一種綠色高效的新提取技術用于羊肚菌多糖提取。