納米二氧化硅對小鼠睪丸間質細胞的毒性作用

方忞芊,孫翊傑,張倩茹,許顯玉,2,陳風雷,2*

(1.揚州大學 獸醫學院,江蘇 揚州 225009;2.揚州大學 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇 揚州 225009)

納米二氧化硅(silica nanoparticles,SNPs)是一種人工合成的納米材料,已被廣泛應用于農業、化妝品、食品添加劑和生物醫學等領域[1]。由于SNPs的廣泛應用,尤其在消費品和生物醫藥方面,增加了人和動物對其接觸的風險[2-3]。根據其物理、化學性質及暴露時間和途徑的不同,SNPs可在多種器官中造成毒性,如肝臟、腎臟、腦、肺臟、卵巢和睪丸[4-6]。SNPs可以穿過血睪屏障,分布在睪丸組織中,導致睪丸毒性[7-9]。

睪丸的主要功能是產生精子和分泌睪酮。研究發現,納米材料的睪丸毒性是由納米顆粒通過不同途徑(包括血液循環或直接接觸)積累造成的,睪丸對納米顆粒積累十分脆弱和敏感[10],如氧化鋅納米顆粒、氧化鈰納米顆粒和SNPs[9,11-12]。SNPs可引起精曲小管損傷,導致精子活力下降[6]。然而,SNPs誘導的睪丸毒性機制還不十分清楚。雖然已有研究報道SNPs在精子發生中的毒性,但SNPs對睪丸間質細胞的毒性研究相對較少[13]。睪丸間質細胞通過促進睪酮的合成和分泌對精子發生起著重要作用。SNPs通過影響睪丸間質細胞從而引起睪丸毒性有待進一步研究。本研究通過體內和體外試驗,探討SNPs對睪丸間質細胞的毒性作用及調控機制,為進一步完善SNPs的生殖毒性研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物昆明小鼠(雄性,28日齡)購自揚州大學比較醫學中心,所有動物實驗方案均得到揚州大學動物保護和倫理委員會批準和同意(獲批編號:202103322)。 小鼠在23～25℃和12 h明/12 h暗循環條件下飼養。

1.2 主要試劑膠原酶Ⅰ購置于美國賽默飛世爾科技公司;Percoll細胞分離液購置于GE Healthcare Life Sciences公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)細胞毒性檢測試劑盒、吖啶橙(acridine orange,AO)和Lyso-Tracker Red染色液購置于碧云天生物技術有限公司;抑肽素(pepstatin,Pep A)購置于MedChemExpress公司;CDST兔多克隆抗體購置于美國Abcam公司。

1.3 主要儀器設備流式細胞儀購置于美國貝克曼庫爾特有限公司;透射電鏡購置于日本日立公司;激光共聚焦顯微鏡購置于德國萊卡公司;Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀購置于英國馬爾文(Malvern)儀器公司。

1.4 SNPs制備和理化性質檢測利用St?ber方法進行SNPs的合成。步驟如下:將1 700 mmol/L無水乙醇、155 mmol/L雙蒸水和26 mmol/L氫氧化銨混合,加入16 mmol/L四乙氧基硅烷室溫攪拌,超速離心后,用蒸餾水和95%乙醇洗滌,保存于無水乙醇中。試驗用SNPs超速離心后,重懸于超純水中。透射電鏡檢測SNPs形態結構并使用Image J軟件分析粒徑大小,Zetasizer Nano ZS檢測SNPs在溶液中的粒徑和電位。

1.5 SNPs處理小鼠將32只雄性ICR小鼠隨機均分為4組,分別為生理鹽水組(對照組)、12.5,25.0和50.0 mg/kg的SNPs組,經尾靜脈注射處理小鼠。每日測體質量,15 d后處死小鼠。將睪丸從腹腔取出,浸泡在改良的戴維森液體組織固定液中(95%乙醇、甲醛、冰醋酸和超純水按3∶2∶1∶2混合),進行蘇木精-伊紅(H&E)染色。

1.6 H&E染色固定后的睪丸樣品分別用梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制作5 μm厚連續切片,按常規方法染色,用中性樹脂封片后,顯微鏡觀察形態結構。

1.7 睪丸間質細胞體外培養從雄性小鼠中取出睪丸,去除白膜后,放入含有1 g/L膠原酶Ⅰ的DMEM/F12中,37℃水浴孵育10 min,加入等量的含FBS的培養液終止消化;睪丸間質細胞重懸并使用Percoll梯度離心后,收集睪丸間質細胞,臺盼藍染色測定細胞活力;將純化的睪丸間質細胞離心、重懸并培養于DMEM/F12培養基中,用3β-羥類固醇脫氫酶檢測睪丸間質細胞純度[14]。

1.8 SNPs在睪丸間質細胞中定位SNPs處理睪丸間質細胞后,PBS洗滌除去多余SNPs,4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的PBS溶液中固定24 h。經PBS洗滌3次后,2%瓊脂糖凝膠進行包埋,4%四氧化鋨中固定,0.5%乙酸鈾染色;經梯度乙醇脫水后,包埋入環氧樹脂;切片后用3%醋酸鈾酰-檸檬酸鉛染色,使用透射電鏡進行觀察拍照。

1.9 LDH染色將3×104個細胞/200 μL培養液/孔接種到96孔板中培養24 h;然后用不同質量濃度的SNPs處理睪丸間質細胞后繼續培養24 h;去除培養液并使用PBS洗滌3次,加入150 μL LDH溶液并混勻;繼續培養1 h,分別取各孔上清120 μL,加入新96孔板中進行樣品測定。

1.10 細胞凋亡測定通過流式細胞術檢測SNPs處理后睪丸間質細胞的凋亡情況。將2 × 106個細胞/2 mL培養液/孔接種到6孔培養板中培養24 h;然后用不同質量濃度的SNPs(300,600和900 mg/L)處理24 h;PBS洗滌和胰蛋白酶消化后,收集細胞,加入含Annexin Ⅴ-FITC和PI的緩沖液重懸細胞,流式細胞術測定細胞凋亡率。

1.11 AO染色將睪丸間質細胞接種到含有蓋玻片的24孔培養板中培養24 h,然后用SNPs處理24 h;PBS洗滌除去多余SNPs后,加入AO染色液,孵育20 min;去除AO染色液后,加入新鮮的細胞培養液;用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

1.12 Lyso-Tracker Red染色將睪丸間質細胞接種到含有蓋玻片的24孔培養板中培養24 h,然后用SNPs處理24 h;PBS洗滌除去多余SNPs后,加入濃度為50 nmol/L的Lyso-Tracker Red染色液,孵育20 min;去除Lyso-Tracker Red染色液后,加入新鮮的細胞培養液,用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

1.13 免疫熒光染色將睪丸間質細胞接種到含有蓋玻片的24孔培養板中培養24 h,然后用SNPs處理24 h;PBS洗滌除去多余SNPs后,4%多聚甲醛固定20 min;用含0.5% Triton X-100的PBS通透10 min;5%牛血清白蛋白封閉 1 h;用兔抗CDST一抗4℃孵育過夜;PBS洗滌后,加入熒光二抗避光孵育1 h,用DAPI孵育10 min;用激光共聚焦顯微鏡進行觀察拍照。

1.14 Western blot檢測使用全細胞蛋白提取試劑盒進行全蛋白提取;使用BCA蛋白含量檢測試劑盒測定總蛋白質量濃度;等量蛋白用10% SDS-PAGE凝膠分離,電印跡法轉移到PVDF膜上;轉膜后,10%的脫脂奶粉封閉1 h;一抗4℃孵育過夜;PBST洗滌后,加入HRP標記的二抗,室溫孵育1 h;PBST洗滌后,使用ECL發光液進行曝光,使用Quantity One軟件進行灰度值分析。

2 結果

2.1 SNPs理化性質為測定合成SNPs理化性質,透射電鏡結果顯示該SNPs是單分散圓球形顆粒(圖1A);隨機挑選透射電鏡圖利用Image J軟件進行粒徑大小分析,結果顯示SNPs粒徑大小為(106.90±13.43) nm(圖1B);利用Zetasizer Nano ZS對SNPs在10 mmol/L NaCl溶液中的流體動力學尺寸和電位進行分析,結果顯示SNPs粒徑大小為 (110.80 ± 26.50) nm并帶有負電荷,zeta電位絕對值為(49.7±6.6) mV[15]。

A.SNPs透射電鏡結果;B.SNPs粒徑大小分析結果

2.2 SNPs改變睪丸的組織結構為了檢測在體SNPs對睪丸的毒性作用,尾靜脈注射SNPs后,采用H&E染色觀察睪丸組織結構變化。H&E染色結果顯示,對照組睪丸組織結構正常,精曲小管內上皮細胞排列規則(圖2Aa),睪丸間質和間質細胞排列緊密,所有生精細胞和支持細胞均正常(圖2Ab);12.5 mg/kg SNPs組睪丸精曲小管內上皮細胞排列規則(圖2Ba),但睪丸間質出現部分缺失及間質細胞減少現象(圖2Bb);25.0和50.0 mg/kg SNPs組睪丸出現明顯的精曲小管萎縮和變形(圖2Ca、Da),睪丸間質細胞數量減少和生精上皮細胞排列紊亂現象(圖2Cb、Db)。

2.3 SNPs定位于睪丸間質細胞溶酶體中為了檢測SNPs是否能夠進入睪丸間質細胞,利用透射電鏡技術對SNPs在細胞中的定位進行了測定。結果顯示,對照組中沒有納米顆粒(圖3A、B),而SNPs組的睪丸間質細胞溶酶體中存在納米顆粒的積累(圖3C、D)。

2.4 SNPs降低睪丸間質細胞活性和增加凋亡為了確定SNPs對睪丸間質細胞的細胞毒性,對SNPs處理后的睪丸間質細胞進行細胞增殖、活性和凋亡測定。LDH結果顯示,SNPs處理睪丸間質細胞后細胞毒性逐漸升高并呈現劑量依賴性特點(圖4A);CCK-8結果顯示,SNPs處理睪丸間質細胞后細胞活性逐漸降低并呈現劑量依賴性特點(圖4B);流式細胞術檢測結果顯示,SNPs處理睪丸間質細胞后,與對照組凋亡率(5.62±0.60)%相比,300,600和900 mg/L SNPs處理組的凋亡率分別是(12.38±1.32)%,(16.11±1.86)%和(22.76±2.42)%,細胞凋亡顯著增加(圖4C、D)。

2.5 SNPs誘導溶酶體損傷為了進一步驗證SNPs對睪丸間質細胞增殖和凋亡的影響機制,對溶酶體膜通透性和酸堿性進行了檢測。使用溶酶體膜通透性染料AO和pH敏感的溶酶體染料Lyso-Tracker Red對溶酶體的通透性和酸度進行評估。激光共聚焦顯微鏡結果顯示,與對照組相比,暴露于SNPs后AO染色綠色熒光和紅色熒光強度均顯著變強(圖5Aa、Ab),Lyso-Tracker Red陽性結構面積顯著增大(圖5Ba、Bb),均與CQ組一致(圖5Ac、Bc)。流式細胞術結果顯示與激光共聚焦顯微鏡結果相一致(圖5C～E)。為了檢驗SNPs對溶酶體完整性的影響,檢測了天冬氨酸蛋白酶組織蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)的亞細胞定位。熒光顯微鏡結果顯示,對照組細胞表現為大的團塊綠色熒光,而SNPs暴露的細胞為小的團塊或散在綠色熒光,CQ組的細胞為彌漫性綠色熒光(圖5F)。Western blot結果顯示,SNPs組CTSD成熟亞型表達水平較對照組顯著下降,這與CQ組一致(圖5G、H)。

A.AO測定睪丸間質細胞中溶酶體通透性(Aa.對照組;Ab.300 mg/L SNPs組;Ac.100 mmol/L CQ組);B.Lyso-Tracker Red測定睪丸間質細胞中酸度(Ba.對照組;Bb.300 mg/L SNPs組;Bc.100 mmol/L CQ組);C.流式細胞術檢測AO染色綠色熒光強度;D.流式細胞術檢測AO染色紅色熒光強度;E.流式細胞術檢測Lyso-Tracker Red染色紅色熒光強度;F.免疫熒光檢測CTSD在睪丸間質細胞中的亞細胞定位;G.Western blot分析溶酶體中CTSD的水平;H.成熟CTSD水平的密度分析

2.6 Pepstatin A抑制SNPs誘導的細胞凋亡為進一步確認溶酶體損傷介導的細胞凋亡,我們使用CTSD抑制劑Pep A和SNPs共處理睪丸間質細胞,流式細胞術結果顯示,與對照組(6.35±0.80)%相比,單獨使用Pep A(5.64±0.76)%凋亡率無顯著性差異;但是與SNPs組(20.08±2.20)%相比,聯合使用Pep A和SNPs (14.30±1.80)%凋亡率顯著降低(圖6A、B)。

A.流式細胞術測定細胞凋亡率;B.細胞凋亡率結果分析柱狀圖

3 討論

SNPs的大規模生產和廣泛應用引起了公眾對其環境暴露風險的關注[16]。在亞洲,每年有數百噸的SNPs被釋放到水、土壤和垃圾填埋場中[17]。盡管SNPs被廣泛認為具有良好的生物相容性,但在前期研究中也報道了SNPs對機體產生的毒副作用[18]。研究表明,SNPs能夠透過血睪屏障,引起雄性生殖系統毒性。SNPs可在睪丸中積累,破壞生精小管,從而抑制精子發生,導致精子的質量和數量下降[6]。SNPs的睪丸毒性不僅能夠影響精子發生,而且可調節機體睪酮水平[15]。睪丸間質細胞是睪丸的重要組成部分,主要參與睪酮的合成和分泌,睪丸間質細胞通過合成和分泌睪酮在精子發生過程中起著重要作用。然而,睪丸間質細胞損傷的機制尚不完全清楚。在本研究中,我們發現溶酶體損傷參與SNPs誘導的睪丸間質細胞凋亡。

根據世界衛生組織(WHO)的空氣質量指南[19],小鼠通過體內尾靜脈注射12.5 mg/kg(低劑量)、25.0 mg/kg(中劑量)和50.0 mg/kg(高劑量)的SNPs(110 nm,球形)。研究發現12.5 mg/kg的SNPs無明顯毒性作用,而25.0和50.0 mg/kg的SNPs能夠引起精曲小管結構異常和睪丸間質細胞減少。通過體外培養原代小鼠睪丸間質細胞我們發現,SNPs能夠引起睪丸間質細胞毒性并呈現劑量依賴性。SNPs通過胞吞作用進入睪丸間質細胞后主要集中在單層膜狀結構溶酶體中,并且通過改變溶酶體的酸堿性和膜的通透性參與SNPs誘導的細胞毒性。

溶酶體是真核細胞中單層膜酸性細胞器,是細胞內重要的降解和代謝中心,溶酶體結構的完整性對于細胞的生存和功能至關重要。溶酶體損傷通常會導致溶酶體膜通透化,溶酶體腔內的組織蛋白酶和蛋白水解酶釋放到細胞質中,激活胞質內一系列級聯反應,降低細胞清除能力,從而觸發細胞凋亡途徑。組織蛋白酶是溶酶體水解酶的一個家族,是溶酶體膜通透化的主要活性蛋白,其中CTSD是溶酶體內重要的組織蛋白酶,與溶酶體相關的細胞凋亡關系較為密切。研究發現,SNPs處理睪丸間質細胞后CTSD呈現小的團塊或散在分布,表明CTSD從溶酶體中釋放到細胞質,進一步研究發現細胞質中的CTSD水平顯著升高,而溶酶體中的顯著下降。前期研究報道顯示,組蛋白酶可以調節BCL-2家族成員BID的活性,從而促進BCL-2相關蛋白寡聚化,使得寡聚化復合體轉移到線粒體外膜上,導致線粒體通透化并釋放細胞色素C,激活線粒體介導的Caspase依賴的細胞凋亡途徑[20]。為了進一步確定組蛋白水解酶介導的溶酶體損傷參與SNPs誘導的睪丸間質細胞凋亡,我們利用CTSD的抑制劑Pep A和SNPs共處理睪丸間質細胞,發現細胞凋亡被抑制,進一步表明溶酶體損傷參與SNPs誘導的睪丸間質細胞毒性的產生。