GC-MS法測定舒更葡糖鈉中基因毒性雜質二甲氨基甲酰氯

丁倩倩 唐新茹 張昌浩▲ 黃曉光 王 雪 孫 雪 楊 慧

1.延邊大學藥學院，吉林延吉 136200；2.吉林省博大偉業藥物研究有限公司，吉林長春 130000

舒更葡糖鈉（sugammadex sodium）是一種改良的新型γ-環糊精，是首個可以在全身麻醉期間逆轉神經肌肉阻滯的選擇性松弛結合劑，其作用機制是通過包裹羅庫溴銨的環戊烷過氫菲環使其失活，從而發揮神經肌肉阻滯的逆轉作用[1-3]。2005年，荷蘭的Organon Biosciences公司首次報道了有關舒更葡糖鈉的臨床使用；2008年7月，由默沙東公司研發的舒更葡糖鈉注射液（商品名：Bridion）宣布在歐洲批準上市，而中國也在2017年4月獲批準上市，并在臨床開始應用[4-5]。

二甲氨基甲酰氯是在合成舒更葡糖鈉的工藝中由所參與的主要原料氯化劑（如草酰氯、磷酰氯、亞硫酰氯）和N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）經Vilsmeier反應形成的一種基因毒性雜質，屬于2A類致癌物[6]。基因毒性雜質是一種可使DNA被直接或間接破壞導致突變、重組及染色體斷裂，最終致癌變及致突變性的物質，具有較低的安全閾值，低濃度時便可產生嚴重的致癌風險[7-11]。因此，建立一種能對舒更葡糖鈉中的二甲氨基甲酰氯殘留量進行準確檢測的方法是必要的。根據人用藥品注冊技術要求國際協調會（International Conference on Harmonization，ICH）M7指南[12]來確定二甲氨基甲酰氯的限度，得到二甲氨基甲酰氯的TD50數值為0.625 mg/（kg·d），而舒更葡糖鈉的最大日劑量（以舒更葡糖鈉活體計）為16 mg/（kg·d），經計算后得到舒更葡糖鈉中遺傳毒性雜質二甲氨基甲酰氯的限度為0.000 07%。根據其限度較低，對儀器的靈敏度要求更嚴格，常規的氣相色譜、液相色譜等難以準確檢測，故本研究采用靈敏度高、定量分析準確、檢測限較低、選擇性高的氣相色譜-質譜聯用技術（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）對舒更葡糖鈉中的二甲氨基甲酰氯進行檢測，可以較好地達到基因毒性雜質痕量分析的要求，以便降低生產成本及提高藥品的質量[13-16]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

7010B-8890氣相色譜-質譜聯用儀（Agilent公司）；VF-624ms毛細管色譜柱（Agilent公司）；BT-125D型電子天平（Sartorius公司）。

1.2 試劑

乙醚（色譜純，成都科隆化工公司）；二甲氨基甲酰氯（批號：16-Nov-LD17-1-06，Lovan Research chermical 公司）；舒更葡糖鈉（批號：2206001、2206002、2207001，吉林省博大偉業制藥有限公司）。

2 方法與結果

2.1 GC-MS條件

2.1.1 色譜條件 毛細管柱為VF-624ms（30 m×0.25 mm，1.4 μm），載氣為氦氣，柱流量為1.5 ml/min；進樣口溫度200℃，進樣體積為1 μl；初始柱溫為40℃，維持2 min；以20℃/min升至250℃，維持8 min。

2.1.2 質譜條件 采用電離源EI，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃，四級桿溫度150℃，電離電壓70 ev，碰撞器為氮氣，溶劑延遲 5 min，采集模式為SIM模式，二甲氨基甲酰氯的采集離子為107。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取二甲氨基甲酰氯20 mg，用乙醚稀釋成每1 ml中含二甲氨基甲酰氯約0.2 mg的溶液，搖勻后即可得到二甲氨基甲酰氯對照品母液。量取母液40 μl置100 ml容量瓶中，用乙醚稀釋至刻度，搖勻后即可得到80 ng/ml的二甲氨基甲酰氯對照品儲備液。取儲備液適量，用乙醚稀釋成每1 ml中含二甲氨基甲酰氯40 ng的溶液即為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取舒更葡糖鈉575 mg于10 ml量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，振搖并用玻璃離心管離心，作為供試品溶液。

2.2.3 混標溶液的制備 精密稱取舒更葡糖鈉575 mg于10 ml量瓶中，加入二甲氨基甲酰氯對照品儲備液適量，用乙醚稀釋成每毫升中含二甲氨基甲酰氯40 ng的混合溶液，振搖并用玻璃離心管離心即可。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 分別精密量取配制好的供試品溶液、二甲氨基甲酰氯的對照品溶液、混標溶液及乙醚各1 μl進樣測定，得到色譜圖（圖1～4）。結果表明，采用上述色譜條件測得的二甲氨基甲酰氯，其保留時間為7.636 min，分離度好，相鄰雜質峰不對其干擾，且空白溶劑、舒更葡糖鈉不干擾二甲氨基甲酰氯的檢測，故方法的專屬性較好。

圖1 空白溶劑乙醚的GC-MS色譜圖

圖2 二甲氨基甲酰氯對照品溶液的GC-MS色譜圖

圖3 供試品溶液的GC-MS色譜圖

圖4 混標溶液的GC-MS色譜圖

2.3.2 檢測限和定量限試驗 取二甲氨基甲酰氯對照品儲備液適量，用乙醚稀釋成合適的濃度，按規定的色譜條件測定，當主成分信噪比約為10∶1的進樣濃度為定量限，信噪比約為3∶1時的進樣濃度為檢測限，測定結果表明二甲氨基甲酰氯的檢測限為4.04 ng/ml，定量限為8.08 ng/ml。

2.3.3 線性關系考察 取對照品儲備液，精密量取1.0、2.5、4.0、5.0、6.0和7.5 ml各置于10 ml量瓶中加乙醚稀釋至刻度，再分別精密量取稀釋后的溶液及對照品儲備液各1 μl進樣測定，得到色譜圖，橫坐標為二甲氨基甲酰氯的濃度，縱坐標為其峰面積，進行線性回歸，得到二甲氨基甲酰氯的線性回歸方程為：Y=49 368X-41 838，相關系數r=0.9999。所得結果表明當進樣量為1 μl時，二甲氨基甲酰氯在8.08～80.80 ng/ml的范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.4 精密度試驗 取對照品溶液，按照設定的色譜條件連續測定6次，記錄色譜圖，測得二甲氨基甲酰氯峰面積的RSD值為3.30%（n=6）。

2.3.5 重復性試驗 取舒更葡糖鈉約575 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，振搖后用玻璃離心管離心，配置6份為供試品溶液；另取對照品溶液，分別精密量取1 μl進樣測定，記錄譜圖，按外標法計算舒更葡糖鈉中二甲氨基甲酰氯的殘留量，結果顯示，經6次測定均未檢出二甲氨基甲酰氯。

2.3.6 回收率試驗 取舒更葡糖鈉約575 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，分別加入對照品儲備液2.5、5.0、7.5 ml，用乙醚稀釋至刻度，振搖后用玻璃離心管離心，各制備3份，作為低、中、高三種濃度的溶液（分別為限量濃度的50%、100%、150%），另按上述方法制備對照品溶液，各1 μl進樣測定，計算回收率。測定結果見表1，結果表明，通過9份樣品測定所得二甲氨基甲酰氯的平均回收率為100.91%（RSD=2.92%），故回收率符合要求。

表1 二甲氨基甲酰氯回收率試驗結果（n=9）

2.3.7 穩定性考察 取供試品溶液置于室溫下，分別放置0、2、4、6、8 h后，精密量取1 μl測定，按外標法以峰面積計算供試品溶液中二甲氨基甲酰氯的含量。結果表明，經8 h的測定二甲氨基甲酰氯均呈未檢出的狀態，故溶液穩定性良好。

2.3.8 耐用性試驗 變動色譜條件各參數[初始溫度（40±2）℃、柱流速（1.5±0.1）ml/min]，分別精密量取對照品溶液和供試品溶液各1 μl測定，記錄色譜圖。結果顯示，供試品溶液在各參數條件下均未檢出二甲氨基甲酰氯，故色譜參數的微小變化對二甲氨基甲酰氯的檢出不影響，耐用性良好。

2.3.9 樣品測定 取3批舒更葡糖鈉，配成供試品溶液，按規定的色譜條件進樣，結果見表2，表明3批舒更葡糖鈉中均未檢出二甲氨基甲酰氯，符合二甲氨基甲酰氯限度不超過0.000 07%的要求。

表2 3批樣品二甲氨基甲酰氯測定結果

3 討論

在摸索色譜條件時，發現采用預設的5∶1的分流比進樣，色譜峰的響應值達不到要求，而不分流進樣時其質譜峰的響應值高，故本研究最終不采取分流進樣。此外本研究還考察了不同的毛細管柱（VF-624ms、VF-WAXms）對二甲氨基甲酰氯檢測的影響，結果發現VF-WAXms毛細管柱檢測出的二甲氨基甲酰氯峰型不好，響應值也較低，而VF-624ms型毛細管柱檢測出的峰型對稱且分離度好，故最終采用該毛細管柱。

實驗操作過程中，本研究發現塑料制品（塑料滴管、塑料離心管）的使用會導致檢測時色譜圖的主峰附近出現雜峰且分離度不符合要求，從而干擾檢測結果，故實驗全程使用玻璃制品（玻璃滴管、玻璃離心管）以避免干擾。

溶劑的確定，預實驗時篩選了舒更葡糖鈉與二甲氨基甲酰氯都能溶解的水溶劑，但其結構中的酰氯鍵（-COCl）遇水不穩定易斷裂，又考察了乙醚、乙腈、醇類等有機溶液，結果表明二甲氨基甲酰氯在乙醚中的溶解度較好且穩定性最佳，同時由于采用的GC-MS較靈敏，故優先選擇色譜純的乙醚。

本研究采用GC-MS建立了有效測定舒更葡糖鈉中基因毒性雜質二甲氨基甲酰氯的方法，并經方法學驗證，相較于單一的氣相色譜，靈敏度得到提高、專屬性和耐用性更好以及檢測時無干擾，可以較好地達到基因毒性雜質痕量分析的要求，可為舒更葡糖鈉中有關基因毒性雜質及其他藥物中二甲氨基甲酰氯的測定提供借鑒。但由于GC-MS儀器較貴，無法在藥廠車間普及，且對儀器使用人員的要求較高，故存在一定的局限性。