非布司他原料藥微生物限度檢查法的建立

鄭域茹 吳燕燕 程 琳 林玉雙

福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建福州 350001

藥品微生物限度檢查是保障臨床用藥的有效性以及藥品安全性的重要措施[1-3]。非布司他為非嘌呤類黃嘌呤氧化酶抑制劑，為新一代痛風(fēng)治療藥[4]。本研究中的非布司他原料藥作為制劑重要的上游產(chǎn)品，其微生物限度是反映產(chǎn)品安全性和質(zhì)量可控性的重要指標(biāo)之一。《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版對(duì)非無菌藥用原料及輔料的微生物限度只規(guī)定了需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，控制菌未作統(tǒng)一規(guī)定[5]。由于該原料藥的下游產(chǎn)品為口服制劑，控制菌還應(yīng)檢查大腸埃希菌。為提高該原料藥的質(zhì)控水平，本研究擬建立非布司他原料藥的微生物限度檢查法，為該藥品的生產(chǎn)管理提供切實(shí)可行、行之有效的方法學(xué)參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器設(shè)備

ME2002E電子天平（梅特勒托利多）、HVA-110高壓蒸汽滅菌器（日本Hirayama）、HFsafe-12CY生物安全柜（上海力康）、HTY-306A過濾系統(tǒng)（浙江泰林）、IPP410培養(yǎng)箱（德國(guó)Memmert）、BagMixer 400CC均質(zhì)器（法國(guó)Interscience）、側(cè)邊過濾膜均質(zhì)袋（法國(guó)Interscience）和VITEK2 COMPACT全自動(dòng)微生物鑒定儀（梅里埃）。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、黑曲霉[CMCC（F）98003]和白色念珠菌[CMCC（F）98001]均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（批號(hào)：210421）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（批號(hào)：210929）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）（批號(hào)：211210）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：200823）和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：200321）均購(gòu)自于北京三藥科技開發(fā)有限公司，經(jīng)培養(yǎng)基適用性檢查，均符合要求。

1.4 稀釋劑與沖洗液

pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和含3%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.5 供試品

非布司他原料藥。

2 方法

2.1 試驗(yàn)用菌懸液的制備

參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則1105的方法制備適宜濃度的菌懸液[5]。

2.2 供試液制備

取非布司他原料藥10 g，加44℃含3%吐溫80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，振搖均勻，制成1∶10供試液，備用。以3%吐溫80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，將1∶10供試液分別稀釋為1∶20、1∶50和1∶100供試液，備用。

2.3 需氧菌總數(shù)（the total aerobic microbial，TAMC）檢查方法的建立與驗(yàn)證

2.3.1 平皿法 方法1：取1∶50供試液，分裝于5支無菌試管中，每支9.9 ml，分別加入0.1 ml白色念珠菌、黑曲霉、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌菌懸液，控制最終含菌量≤100 cfu/ml，作為試驗(yàn)組。分別吸取上述混合液2 ml置直徑為90 mm的平皿中（1 ml/皿），隨即注入TSA培養(yǎng)基，置33℃培養(yǎng)2～3 d，點(diǎn)計(jì)平板上的菌落數(shù)。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版的要求，制備供試品對(duì)照組和菌液對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，并計(jì)算5種試驗(yàn)菌的回收率。回收率=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)×100%[5-6]。

方法2：參照方法1的操作，將方法1的1∶50供試液替換為1∶100供試液。

2.3.2 薄膜過濾法 采用薄膜過濾法，主要考察兩種加菌方式對(duì)試驗(yàn)菌回收率的影響。第一種加菌方式為供試液制備環(huán)節(jié)加菌，設(shè)置A、B、C、D四種方法；第二種加菌方式為在培養(yǎng)前加菌，即薄膜過濾法的最后一次沖洗液中加菌，設(shè)置E和F兩種方法。具體操作如下。

方法A：取1∶10供試液1 ml，加入1 ml菌含量≤100 cfu的金黃色葡萄球菌，并加入100 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋，薄膜過濾后，分別用300、500、700 、1000 ml的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗薄膜，每次100 ml，濾干，將膜貼于TSA平皿上，并按要求培養(yǎng)。

方法B：將方法A中的沖洗液pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替換為含3%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，其余操作參照方法A。

方法C：將方法A中1∶10供試液替換為1∶100供試液，其余操作參照方法A。

方法D：將方法C中的沖洗液pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替換為含3%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，其余操作參照方法C。

方法E：取1∶10供試液1 ml，加入100 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋，薄膜過濾后，分別用300、500、700、1000 ml的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗薄膜，每次100 ml，在最后一次的沖洗液中加入1 ml菌含量≤100 cfu的金黃色葡萄球菌，濾干，將膜貼于TSA平皿上，并按要求培養(yǎng)。

方法F（含中和劑的沖洗液）：將方法E中的沖洗液pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替換為含3%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，其余操作參照方法E。

上述五組同法檢測(cè)菌液對(duì)照組和供試品對(duì)照組，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，并計(jì)算金黃色葡萄球菌的回收率。

2.4 霉菌和酵母菌總數(shù)（the total yeasts and mould，TYMC）檢查方法的建立與驗(yàn)證

2.4.1 均質(zhì)袋-平皿法結(jié)合使用 本研究使用的均質(zhì)袋帶有孔徑小于250 μm的濾膜，濾膜將均質(zhì)袋分為兩側(cè)，加供試液側(cè)稱為內(nèi)側(cè)，相對(duì)應(yīng)濾膜的另一側(cè)稱為外側(cè)。

取1∶10供試液100 ml全部轉(zhuǎn)移至過濾型均質(zhì)袋的內(nèi)側(cè)，加入白色念珠菌菌懸液，控制最終含菌量≤100 cfu/ml，均質(zhì)器拍擊1 min，作為試驗(yàn)組。分別吸取均質(zhì)袋內(nèi)外兩側(cè)的上述混合液各15 ml，置直徑為90 mm的無菌平皿中（1 ml/皿），隨即注入SDA培養(yǎng)基，23℃培養(yǎng)5 d，點(diǎn)計(jì)平板上的菌落數(shù)。按照試驗(yàn)組操作方法，取稀釋液替代供試品溶液，作為菌液對(duì)照組。

2.4.2 薄膜過濾法 取1∶10供試液1 ml，加入1 ml菌含量≤100 cfu的黑曲霉懸液，并加入100 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋，薄膜過濾后，用300 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗薄膜，每次100 ml，濾干，將膜貼于SDA平皿上，并按要求培養(yǎng)。白色念珠菌依照此法操作。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，并計(jì)算2株供試菌的回收率。

2.5 控制菌大腸埃希菌檢查方法的建立與驗(yàn)證

取2.2制備的1∶10供試液10 ml，加到100 ml的TSB培養(yǎng)基中，同時(shí)接種菌含量≤100 cfu的大腸埃希菌菌懸液，33 ℃增菌24 h后取1 ml到100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，43℃培養(yǎng)24～48 h后劃線于麥康凱瓊脂平板，33℃培養(yǎng)18～72 h。采用微生物鑒定儀對(duì)菌落生長(zhǎng)進(jìn)行鑒定，并根據(jù)鑒定結(jié)果判斷方法適用性試驗(yàn)是否可行。同時(shí)分別制備供試品對(duì)照組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。

2.6 數(shù)據(jù)處理

由于微生物菌落數(shù)服從泊松分布，2.4.1的試驗(yàn)組和菌液對(duì)照組均質(zhì)袋濾膜兩側(cè)的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果需先經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，再采用Minitab軟件對(duì)lg值進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，當(dāng)lg值符合正態(tài)性分布時(shí)采用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，最后采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析[7-8]，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 TAMC檢查方法的建立與驗(yàn)證

3.1.1 TAMC平皿法的試驗(yàn)結(jié)果 非布司他原料藥為白色粉末，略溶于二甲基亞砜、甲醇，在水中幾乎不溶[9]。吐溫具有很強(qiáng)的增溶效果[10-13]，本研究的稀釋液采用添加3%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，制備的供試品可均勻分散在稀釋液中。但1∶10和1∶20供試液含有較多的白色藥物，采用平皿法進(jìn)行計(jì)數(shù)，不溶的白色藥物對(duì)菌落計(jì)數(shù)產(chǎn)生較大的干擾。因此本研究采用1∶50和1∶100稀釋級(jí)作為需氧菌總數(shù)平皿計(jì)數(shù)法的供試液。非布司他本身帶有較強(qiáng)的抑菌性，稀釋級(jí)為1∶50時(shí)，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均無法生長(zhǎng)。當(dāng)稀釋級(jí)為1∶100時(shí)，金黃色葡萄球菌的回收率仍然達(dá)不到50%，不符合要求。見表1。

表1 需氧菌總數(shù)平皿法檢查試驗(yàn)結(jié)果

3.1.2 TAMC薄膜過濾法的試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)3.1.1的試驗(yàn)，對(duì)非布司他最敏感的菌株為金黃色葡萄球菌，因此本部分以金黃色葡萄球菌作為供試菌。對(duì)于供試液環(huán)節(jié)加菌試驗(yàn)組，本研究設(shè)置A、B、C、D四個(gè)方法，結(jié)果表明采用1∶10供試液，不管沖洗液有沒有加3%吐溫80作為中和劑（沖洗量1000 ml）試驗(yàn)菌的回收率均<50%（方法A和B）；而采用1∶100供試液，沖洗液不添加中和劑，回收率同樣達(dá)不到50%（方法C），僅當(dāng)沖洗液添加中和劑且沖洗量達(dá)1000 ml時(shí)，方法D的試驗(yàn)菌回收率達(dá)到50%。而對(duì)于最后一次沖洗液加菌的試驗(yàn)組，本研究設(shè)置E和F兩個(gè)方法，采用1∶10供試液，沖洗量為700 ml，試驗(yàn)菌回收率為60%以上（方法E），符合要求；當(dāng)沖洗液中添加3%吐溫80，沖洗量降低為300 ml，試驗(yàn)菌的回收率達(dá)70%以上（方法F）。見表2。

表2 金黃色葡萄球菌回收率（%）

因此，若僅考慮回收率在50%～200%即符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020版要求，非布司他原料藥的需氧菌總數(shù)方法驗(yàn)證可采用供試液階段加菌，制備1∶100供試液，沖洗液1000 ml（《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版建議沖洗量一般不超過500 ml，最多不得超過1000 ml[5]）的方法D，但考慮到大量沖洗可能造成濾膜孔徑的變化而導(dǎo)致無效檢驗(yàn)，也可能會(huì)對(duì)藥品實(shí)際污染的本就受損或者亞致死的微生物進(jìn)一步造成損傷，本研究擬采用在薄膜過濾最后一次沖洗液中加菌的方法F，取1∶10的供試液1 ml，含中和劑沖洗300 ml/膜，作為建立需氧菌總數(shù)方法適用性驗(yàn)證的方案。

3.1.3 TAMC檢查方法適用性結(jié)果 采用3.1.2建立的方法F，對(duì)非布司他原料藥的需氧菌總數(shù)進(jìn)行方法適用性研究，結(jié)果見表3，5株試驗(yàn)菌的回收率均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版的規(guī)定。

表3 TAMC檢查方法適用性結(jié)果

3.2 TYMC檢查方法的建立與驗(yàn)證

3.2.1 過濾型均質(zhì)袋的濾除對(duì)微生物的影響 試驗(yàn)組和菌液對(duì)照組均質(zhì)袋濾膜兩側(cè)的菌落見表4，將計(jì)數(shù)結(jié)果取對(duì)數(shù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的均質(zhì)袋內(nèi)、外側(cè)的P值分別為0.411和0.915，菌液對(duì)照組的濾膜內(nèi)、外側(cè)的P值分別為0.245和0.673，均大于0.05，表明試驗(yàn)組和菌液對(duì)照組均質(zhì)袋兩側(cè)的數(shù)據(jù)都接受95%概率下的正態(tài)性分布。等方差檢驗(yàn)結(jié)果顯示，菌液對(duì)照組濾膜兩側(cè)數(shù)據(jù)之間均有方差齊性，試驗(yàn)組濾膜兩側(cè)的數(shù)據(jù)也具有方差齊性。雙樣本t檢驗(yàn)對(duì)菌液對(duì)照組的濾膜內(nèi)、外側(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P=1.00 > 0.05，表明內(nèi)、外側(cè)菌數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同法分析試驗(yàn)組的濾膜內(nèi)、外側(cè)數(shù)據(jù)，表明試驗(yàn)組中均質(zhì)袋濾膜內(nèi)外兩側(cè)的白色念珠菌的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00 < 0.05）。濾膜雖然能濾除供試液中較大顆粒的藥粉，但是同時(shí)也會(huì)濾除供試液中微生物，因此不適用于非布司他原料藥計(jì)數(shù)檢查中使用。

表4 濾膜兩側(cè)的菌落數(shù)

3.2.2 TYMC檢查方法適用性結(jié)果 由于藥渣干擾平皿法的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，本研究采用薄膜過濾法對(duì)霉菌酵母總數(shù)計(jì)數(shù)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。在對(duì)本品的需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的方法學(xué)驗(yàn)證可知，試驗(yàn)菌白色念珠菌和黑曲霉對(duì)非布司他原料藥均不敏感。因此采用1∶10供試液1 ml，pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗300 ml，對(duì)三批非布司他原料藥進(jìn)行方法適用性研究，結(jié)果見表5，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版的規(guī)定。

表5 TYMC檢查方法適用性結(jié)果

3.3 控制菌大腸埃希菌檢查方法的建立與驗(yàn)證

采用2.2制備的1∶10供試液，取10 ml接種至100 ml TSB進(jìn)行非布司他原料藥的大腸埃希菌的適用性試驗(yàn)，結(jié)果均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。見表6。

表6 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

本研究的材料為原料藥，其微生物控制對(duì)制劑具有重要影響。為建立一種對(duì)樣本影響小，操作效率高的方法，首先需要開展方法適用性研究[14]。《中華人民共和國(guó)藥典》從2015年版開始，在微生物限度檢查微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）的規(guī)定中指出，方法適用性實(shí)驗(yàn)中應(yīng)首先在供試液環(huán)節(jié)加入驗(yàn)證菌株進(jìn)行回收率測(cè)定[15]。理論上這樣的規(guī)定既考慮到樣品因素，也考慮到檢驗(yàn)過程對(duì)檢出對(duì)象的影響，但是這一理想狀態(tài)在現(xiàn)實(shí)中卻不易實(shí)現(xiàn)[16]。本研究嘗試研究不同加菌方式在需氧菌總數(shù)方法驗(yàn)證中的通過情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)非布司他原料藥在1∶10供試液中加入試驗(yàn)菌，未經(jīng)過進(jìn)一步稀釋，是無法通過方法驗(yàn)證的。馬仕洪等[16]曾對(duì)95種樣品不同加菌環(huán)節(jié)進(jìn)行研究，結(jié)果45%的品種同樣無法在1∶10供試液階段加菌通過方法驗(yàn)證。因此本研究將加菌環(huán)節(jié)移至薄膜過濾最后一次沖洗液中加菌。

在需氧菌總數(shù)方法適用性研究過程，本研究發(fā)現(xiàn)在采用1∶10稀釋級(jí)供試液薄膜過濾后，沖洗700 ml試驗(yàn)菌的回收率60%以上；而當(dāng)沖洗液中添加吐溫后，沖洗300 ml試驗(yàn)菌的回收率即可達(dá)到70%以上。顯然吐溫可有效中和供試品的抑菌作用，減少?zèng)_洗液用量，簡(jiǎn)化操作。

平皿法因其操作簡(jiǎn)便快捷，在微生物計(jì)數(shù)中應(yīng)用最為廣泛。為消除不溶性供試品對(duì)平皿菌落計(jì)數(shù)產(chǎn)生干擾，本研究在進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性考察時(shí)，擬采用過濾型均質(zhì)袋攔截不溶藥品。均質(zhì)袋在食品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用已非常普遍，藥品微生物檢查中亦有研究顯示均質(zhì)袋過濾膜63 μm的孔徑不會(huì)使伏立康唑的微生物被濾除[17]。本研究采用濾膜孔徑小于250 μm的過濾型均質(zhì)袋，濾膜外側(cè)的供試液藥品顆粒細(xì)小，分布均勻，菌落在平板更明顯，易于點(diǎn)數(shù)，但濾膜內(nèi)外兩側(cè)的試驗(yàn)菌數(shù)卻存在顯著性差異。這可能是由于非布司他原料藥某些細(xì)小的藥粉顆粒堵塞了均質(zhì)袋的濾膜孔徑，阻擋了試驗(yàn)菌在濾膜的流動(dòng)，從而導(dǎo)致濾膜兩側(cè)菌落數(shù)不均勻分布。因此不同供試品由于性狀和特性各異，無法生搬硬套其他樣品的檢驗(yàn)方法，在檢驗(yàn)方法中采取的任何處理，都應(yīng)不影響微生物的檢出，需經(jīng)科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)確認(rèn)其有效性方能采用。