熵權法聯合正交試驗優選蒼柏洗劑的水提工藝

蔣翠平 熊 丹 陶葉琴 謝宗明 高明果

湖南省瀏陽市中醫醫院制劑科，湖南瀏陽 410300

蒼柏洗劑方作為瀏陽市中醫醫院臨床經驗方，已在臨床應用十余年，主治濕熱蘊結之濕瘡、丹痧、帶下病、陰瘡等，療效確切。該方由黃柏、蒼術等7味飲片組成，全方共湊清熱利濕，祛濕止癢之效。原湯劑煎煮外洗，存在患者用藥依從性差，攜帶、儲存不方便等問題，故擬將其制備成洗劑，也能最大限度地保留原湯劑的有效成分。熵權法[1-3]根據各指標觀測數值所提供的信息，來客觀地賦予各指標相應權重系數，近年來逐漸被應用于中藥制藥行業。本試驗應用正交設計法聯合熵權法，以加水量、提取時間及提取次數為考察三因素，鹽酸小檗堿含量及干浸膏收得率的綜合評分結果為考察指標，優選蒼柏洗劑的最佳水提工藝，為其工業化生產和進一步開發應用提供數據支持和前期基礎。

1 儀器與試藥

LC-10AT高效液相色譜儀（日本島津）；BS224S-CW型電子天平（德國賽多利斯）；DHG-9240A電熱鼓風干燥箱（上海一恒）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒）。藥材購于湖南省金實堂中藥飲片有限公司，經鑒定符合要求。鹽酸小檗堿（批號：110713-201212）來自中國食品藥品檢定研究院；色譜用乙腈；制劑室自制純化水；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 鹽酸小檗堿的含量測定

2.1.1 色譜條件[4-8]采用Inertsil ODS-3C色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.15%磷酸溶液（A）-乙腈（B）流動相梯度洗脫，洗脫程序：0～15 min，15%A；15～18 min，30%A；18～30 min，30%A；30～33 min，15%A；33～35 min，15%A；進樣體積：20 μl；流速：1.0 ml/min；檢測波長：265 nm；柱溫：30℃。

2.1.2 溶液的制備 對照品溶液，精密稱定對照品（鹽酸小檗堿），加純化水制成鹽酸小檗堿濃度為79.20 μg/ml的對照品溶液。

供試品溶液，根據蒼柏洗劑處方配比分別稱取飲片，共計62.5 g，置1000 ml圓底燒瓶，加10倍量純化水，浸泡60 min，加熱煎煮回流提取1.5 h，濾過即得提取液。取提取液，離心，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

陰性樣品溶液，稱取處方中各飲片（除黃柏外），按上述方法制備陰性樣品溶液（缺黃柏），即得。

2.1.3 專屬性考察 分別精密吸取上述三種溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果供試品溶液（B）在與對照品溶液（A）在同一保留時間處（tR=26.3 min）有一高峰，但陰性樣品溶液（C）在此無相應色譜峰，表明該方法陰性無干擾，專屬性良好。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.1.4 標準曲線建立 分別配制質量濃度為12.4、24.8、49.5、99、198、396 μg/ml的鹽酸小檗堿對照品溶液，按照“2.1.1”項色譜條件，以溶液濃度值（x）作為橫坐標，峰面積積分值（y）作為縱坐標，制作標準曲線，得線性回歸方程y=77430x+2×106（r=0.9995）。表明鹽酸小檗堿在12.4～396.0 μg/ml范圍內線性關系良好。見圖2。

圖2 標準曲線圖

2.1.5 精密度試驗 取對照品溶液20μl按“2.1.1”項色譜條件重復進樣5次，鹽酸小檗堿峰面積RSD值為2.77%，說明該儀器具備良好的精密度。

2.1.6 重復性試驗 取平行配制的6份供試品溶液，分別進樣檢測，結果鹽酸小檗堿峰面積RSD值為2.30%，說明該方法具備良好的重復性。

2.1.7 穩定性試驗 取已制備同一供試品，分別于0、2、4、8、12、24 h時注入液相色譜儀，鹽酸小檗堿峰面積RSD值為2.46%，說明在24 h內溶液穩定性較好。

2.1.8 加樣回收率 取供試品溶液6份（含量已知），每份2 ml，分別精確加入對照品溶液2 ml并定容至10 ml，按“2.1.1”項下色譜條件檢測，鹽酸小檗堿平均回收率為101.30%，RSD值為2.45%。表明該方法準確性良好，見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.2 提取工藝優化[9-12]

2.2.1 浸泡時間的考察 以吸水率為考察指標，采取單因素實驗進行考察。結果藥材隨浸泡時間的延長吸水率增大，在60 min時達到最大吸水率，說明藥材吸水已經達到飽和，此時的吸水量為藥材量的133.10%，因此將藥材浸泡時間定為60 min。

2.2.2 正交試驗優化提取工藝 參考文獻并在預實驗基礎上，按處方比例稱取藥材共62.5 g，共9份。以提取次數（A）、提取時間（B）、加水量（C）作為考察因素，以鹽酸小檗堿含量和干膏得率的綜合評分結果為考察指標（綜合評分值=a/amax×0.4446×100+b/bmax×0.5553×100，a為干浸膏得率，b為鹽酸小檗堿含量），按L9（34）正交表進行9組正交試驗。因素水平見表2。熵權法[13-16]計算各指標權重值見表3。按綜合評分公式計算，正交試驗設計以及相應結果與分析，見表4～5。

表2 正交試驗因素與水平

表3 評價指標權重值

表4 正交試驗結果

表5 方差分析結果

2.2.3 試驗設計結果分析 由表4～5可知，極差A>C>B（R=29.930>4.810>4.390），即對綜合評分結果影響最大的為A因素提取次數，影響最小的是提取時間，其中A因素差異有統計學意義（P< 0.05）。A3>A2>A1，B2>B3>B1，C2>C1>C3，綜合生產實際情況，選擇最佳提取工藝為A3B2C2。

2.2.4 驗證試驗 為考察蒼柏洗劑優選提取工藝的穩定性及可行性，分別按最佳優選條件對三組水提液進行驗證。結果浸膏得率的RSD=0.66%，鹽酸小檗堿含量的RSD=0.34%，表明優選的工藝穩定可行，符合預期設計。

3 討論

二妙散源于古方《丹溪心法》，是用于治療濕熱證的基礎名方[17]，而蒼柏洗劑是由經方“二妙散”[18]加減化裁而來。方中黃柏為君藥，善清下焦之濕熱；蒼術為臣藥，長于健脾燥濕，二藥配伍，標本兼顧；苦參滲利濕熱，滑石外用祛濕斂瘡；蛇床子、地膚子祛風止癢；土茯苓祛濕解毒。諸藥合用使濕熱除，風癢止。

本方中君藥黃柏主要含生物堿類，是其活性成分之一，主要包括原小檗堿型生物堿如小檗堿等。黃柏水煎劑具有抗炎的藥理作用，能使金黃色葡萄球菌感染小鼠的病死率得以降低，其水提取物涂層導尿管能有效預防泌尿系統感染[19]。同時考慮原湯劑為水煎煮，在臨床使用多年，療效確切，因此本研究采用水提法。依照《中華人民共和國藥典》2020年版一部[4]，本方中黃柏應檢測小檗堿含量，故將小檗堿含量作為考察提取工藝的評價指標之一。本試驗運用HPLC法對鹽酸小檗堿含量進行了測定并進行了方法學考察，結果鹽酸小檗堿的分離度高，方法專屬性好，優選的條件下測定的精密度、重復性、穩定性良好，可作為其含量測定方法。本研究還運用HPLC法對臣藥蒼術中蒼術素進行了含量測定，選用了3種色譜方法，試驗結果均不理想。

熵權法[3]則根據各指標變異程度，利用信息熵先計算出各指標熵權值，再通過修正，得到相對客觀的指標權重。熵權法應用于正交試驗確定各指標權重，據此計算得出綜合評分，提高了試驗結果的科學性與嚴謹性。

本研究應用正交試驗，設置考察因素為加水量、提取時間和提取次數，考察指標為鹽酸小檗堿含量與干膏得率的綜合評分值，運用熵權法對試驗數據進行客觀處理，確定各指標的權重系數，使試驗結果更科學合理。結果確定蒼柏洗劑的最優水提工藝為第1次加10倍量水，浸泡1 h，煎煮1.5 h，第2次加8倍量的水，煎煮1 h，第3次加6倍量的水，煎煮0.5 h。通過驗證試驗說明，本次優選的水提工藝是穩定、可行的，為蒼柏洗劑商業化擴大生產提供了試驗數據指導。