四大名醋發酵微生物研究現狀

曹施靜，胡海霞，楠 極

（內蒙古農業大學職業技術學院，內蒙古 包頭 014109）

0 引言

食醋采用多菌種混合發酵工藝，由眾多微生物發酵而形成的一種酸味調味劑。食醋釀造主要包括固態和半固態工藝，微生物在開放式環境下經過各種作用機制及相互作用從而釀造出食醋[1-2]。食醋生產原料種類豐富，主要包括高粱、大米、小米、麩皮、小麥等，不同的原料所呈現的食醋品質有所不同。在我國，傳統食醋主要以“四大名醋”而聞名。山西老陳醋，以谷物為主要原料，酒化完成后再經醋酸發酵等工序釀制而成；四川保寧醋，其主要原料為麩皮，輔料為小麥、玉米和大米，通過生料固態發酵的方式在低溫條件下釀造而成；鎮江香醋，其主要原料為優質糯米，通過固態發酵技術發酵而成；福建永春老醋，其主要經過多次添加糯米等原料，通過液體發酵方式并經過3 年以上陳釀而成。

山西陳醋作為四大名醋之一，被譽為國家地理標志產品，富含豐富的氨基酸等營養成分，具有軟化血管等獨特功效；四川保寧醋，具有促進鈣、鐵吸收、降脂減肥、預防動脈硬化和美容養顏等功能性作用；鎮江香醋，具有降血壓、血脂、分解乳酸、抗菌發等功效；福建永春老醋含有多重營養成分和有益微生物，經常食用福建永春老醋能增進食欲、開健脾胃，對治療皮膚病、動脈硬化、高血壓等有重要功效。

近年來，國內外有關傳統四大名醋發酵過程中的功能微生物及作用機制剖析越來越深入，對釀造過程中的微生物菌種及發酵作用機理的深入剖析，將有利于開辟新的市場，滿足食醋市場需求。在傳統四大名醋研究中也存在著一些難題，由于大多數微生物在環境中難以培養，單純依靠傳統的分離培養方法對發酵過程中的功能微生物組成及豐度變化很難測定。目前，大多數研究多采用分子生物鑒定及基因測序等方式對發酵過程中的微生物結構組成等進行研究，為食醋研究提供一定的理論指導和現實意義。

1 發酵微生物種類

1.1 霉菌

霉菌主要產生于淀粉糖化階段，在此過程中，糖在淀粉前期作用下形成，氨基酸在蛋白質前期作用下形成。除此之外，在發酵過程中還會產生蛋白酶，對原料中產生的各種氨基酸和多肽具有分解作用，蛋白酶的含量是衡量食醋品質優劣的一個標準。王佳麗等人[3]從山西老陳醋大曲樣品中篩選鑒定出75 株霉菌，經過測序發現，黑曲霉和米曲霉在大曲中占據主要地位。王龍[4]通過菌種分離法從山西老陳醋中分離篩選到2 株高產酶的霉菌菌株（M3，M8），經過鑒定M3 菌株為犁頭霉屬，M8 菌株為曲霉屬。

1.2 酵母菌

酵母菌主要產生于酒精發酵階段，在發酵過程中為其他菌種提供營養物質，提升食醋的風味和醋體品質。酵母菌由于在發酵過程中處于無氧環境，在酶的作用下，把糖最終轉換成乙醇和CO2，最終以醋酸的形式呈現出來，該過程提供了一個基于代謝產物呈遞的簡單相互作用。范三紅等人[5]對山西陳醋微生物群落進行測序發現伊薩酵母菌屬在整個發酵過程中都處于優勢地位。Zhang Qi 等人[6]通過分離法從山西老陳醋大曲中純化篩選出了一株酵母菌（Y14）。經過基因測序和生化鑒定，大曲酵母Y14 為產酯能力最高的東北畢赤酵母（Pichia manshurica）。

1.3 乳酸菌

乳酸菌主要產生在醋酸發酵階段，其產生的有機酸類賦予食醋特殊的風味物質。乳酸菌中富含不揮發性酸，在食醋發酵過程中，乳酸菌產生的相關產物具有防腐殺菌、緩解食醋刺激口感和改善食醋品質的作用。此外，乳酸菌在風味香氣方面也發揮著重要作用，其代謝產生的酶系能將蛋白質轉化分解為氨基酸[7]。杜宏福等人[8]對山西老陳醋酒精及醋酸發酵微生物構成與有機酸變化關系進行研究，結果表明，在酒精發酵階段，乳酸菌產量及其多樣性呈上升趨勢。邢曉瑩等人[9]從山西老陳醋中篩選得出54 株乳酸菌，經過進一步的產酸能力分析，發現其產酸可達（9.56±0.23） g/L，同時具有耐高溫的性能。張雅琳等人[10]對四川麩醋發酵中的細菌微生物構成和變化規律進行基因測序分析，結果表明在細菌微生物組成中，主要優勢細菌為耐酸乳桿菌和巴氏醋桿菌。

1.4 醋酸菌

醋酸菌作為醋酸發酵的一類重要的微生物，在發酵過程中發揮著重要作用，能將乙醇氧化成乙酸，影響食醋的品質與口感[11-12]。在食醋發酵過程中，醋酸菌產酸能力的大小與工藝生產有著直接關系，篩選性能優良的醋酸菌對提高企業生產效率發揮重要影響。王夢穎等人[13]對山西老陳醋細菌組成和微生物相對豐度通過基因測序技術進行分析，表明在整個發酵過程中，乳桿菌屬、醋酸桿菌屬及Faecalibacterium 在細菌種類中占有絕對比例。華青松等人[14]從鎮江香醋前期篩選出來的醋酸菌中分離得到 2 株耐高溫及產酸能力強的醋酸菌，并且將其命名為菌株AABA，AABC，經過16S rDNA 基因鑒定，菌株AABA，AABC 都是巴氏醋酸桿菌屬。此外，醋酸菌AABA 生長狀態在37 ℃最好，醋酸菌AABC 生長狀態在40 ℃最好。在產酸能力方面，醋酸菌AABA 為45.5 g/L，醋酸菌AABC 為28 g/L。

在食醋整個生產中，主要功能微生物是霉菌、酵母菌、乳酸菌及醋酸菌，霉菌在食醋初期發酵過程中能將淀粉轉化為糖類物種，為微生物提供一定的營養物質，為酒精發酵提供良好的前提；酵母菌能將糖類物質轉化為遺傳，提供發酵動力；乳酸菌中的有機酸類能賦予食醋良好的口感及品質；醋酸菌能將乙醇氧化為醋酸，正是通過這些發酵的微生物的協同作用，最終呈現出來風味多樣的食醋[15-17]。

2 四大名醋發酵為微生物研究

2.1 Alpha 多樣性指數

在已有多樣性指數內容研究中，Shannon、Simpson 代表著多樣性，Chao1 和ACE 代表豐富度。其中Shannon 和Simpson 指數代表物種分布多樣性和均勻度情況，分布越均勻表示多樣性也就越高，相應指數變化也就越大；Chao1 和ACE 指數表示物種總數，物種總數越大表示豐富度越高，相應指數變化也就越大。程荷芳[18]高通量測序技術對四川麩醋發酵過程中的菌種多樣性進行測序分析。研究表明，在發酵初期最高的是Shannon 和ACE 指數，但在發酵過程中多樣性和豐富度指數開始逐漸下降，在末期又呈上升趨勢，在整個醋酸發酵過程中，乳桿菌屬和醋桿菌屬處于優勢地位。寇容等人[19]利用測序技術分析山西陳醋不同發酵時段醋醅樣品的微生物多樣性及組成情況。研究發現，細菌群落微生物分布比真菌群落分布均勻，在Shannon 和Simpson 多樣性指數也就越大；在Chao1 和ACE 豐富度指數方面，細菌群落也高于真菌群落，根據其上結論得出細菌群落比真菌群落更具有豐富性。

2.2 微生物多樣性曲線

樣品稀釋曲線用來評價測序量是否可以占據所有微生物菌群，并間接反映物種的豐富度，也可表示取樣是否適量。Shannon-Wiener 曲線可以根據在不同測序深度的各樣品測序量來構建微生物多樣性指數曲線，反映各樣品在不同測序量多樣性變化。李雅茹[20]通過測序技術對山西陳醋醅微生物多樣性及組成情況進行研究。分析發現，在多樣性及豐富度變化情況中，細菌大于真菌；此外，大曲中的優勢細菌和真菌屬分別為乳酸桿菌屬和覆膜孢酵母屬。Zhu Yunping 等人[21]通過高通量測序和代謝組學的方法對山西老陳醋微生物細菌演替和風味形成進行探究。研究表明，早期優勢細菌為泛菌、片球菌、乳球菌和根瘤菌；中期優勢細菌為乳酸菌（67.72%）；后期優勢細菌為醋酸桿菌、小馬桿菌和克氏桿菌。孟燕華[22]利用高通量測序技術對醋醅樣品中的微生物多樣性進行分析，結果表明，乳桿菌屬和醋桿菌屬屬于優勢菌屬。此外，乳桿菌屬的豐富度大于醋桿菌屬，在發酵過程中占據主要優勢。崔寧波[23]對食醋原料及大曲樣品利用高通量進行測定分析，結果表明，釀酒酵母在原料中為優勢真菌，相對豐富占比為99.73%；黑曲霉在大曲為優勢菌種，相對豐度占比為98.86%。

2.3 物種分布情況

按照分類學分析結果，可將群落組成分為門、綱、目、科、屬、種這幾大類。王俊奇等人[24]通過高通量測序和分子標記對永春老醋醋酸發酵過程中醋醅、成品醋和不同陳釀時期細菌、真菌多樣性演替規律進行分析，結果發現，成品醋和1 年陳釀在綱水平上，α - 變形菌綱和芽孢桿菌綱是占有很大比例；在屬水平上，具有絕對優勢的是醋酸桿菌屬和乳桿菌，細菌群落在10 年陳釀中沒有檢測到；在真菌多樣性動態變化研究中，酵母綱和散囊菌綱在4個不同發酵階段的樣品中都具有一定比例。Nie Zhiqiang 等人[25]對山西老陳醋大曲中的細菌和真菌結構借助PCR-DGGE 測序技術進行研究，結果顯示，在大曲的發酵過程中覆膜孢酵母屬、曲霉菌屬、畢赤酵母屬、紅曲霉等為主要優勢真菌。

3 發酵微生物關聯作用研究

傳統食醋在發酵過程中由于環境開放性、菌種結構的復雜性，導致發酵過程由多個微生物菌種通過相互作用形成，由于這些作用機制的存在，最終呈現了各種交互作用關系，從而影響了群落的結構組成及功能。在互利共生關系中，微生物菌種相互受益；在偏利共生關系中，一種微生物菌種受益，而另一種微生物不受影響；競爭關系指微生物菌種通過搶奪營養物質及限制多種生長因子而獲得優勢地位的現象；寄生是指通過消耗另一種微生物而使自身收益的關系；中立是指2 種微生物自身代謝能力的差距，從而導致生長互不干涉的現象。

寇蓉[26]對鎮江香醋釀造過程中分離的優勢細菌屬的相互作用通過原位模擬培養和異位培養方法進行分析，研究發現在醋醅中乳酸桿菌和醋酸桿菌可以同時穩定存在，但在發酵條件的改變下，不同種類的乳酸桿菌和醋酸桿菌其共現關系也隨著變動。有研究對山西老陳醋釀造過程中主要乳酸桿菌（Lactobacillus（L） . helveticus CGMCC 1.1877） 和醋酸桿菌（Acetobacter (A). pasteurianus CP-A11） 的相互作用通過原位模擬共培養方法進行了深入剖析，研究發現，共培養對乳酸桿菌有抑制作用，而對醋酸桿菌有促進作用。目前，微生物作用機理在食醋釀造過程中對微生物動態變化和生長代謝起著關鍵作用，將不同的優良菌株應用于不同發酵過程，對食醋品質和穩定性具有重要影響，該研究將對食醋釀造具有重要的理論價值和現實意義。

4 高通量測序技術的應用

該測序技術能同時對數量非常多的基因分子片段進行測定。在保持高精準度的同時，降低了檢驗成本并提升了測定速度。如今在傳統發酵食品中被廣泛應用，為傳統發酵食品開發研究提供了現實指導和參考。通常來說，發酵食品主要通過微生物在發酵過程中的轉化作用而形成。由于開放式的環境，使微生物組成豐富多樣[27]，對發酵體系的研究必須以代謝機制研究為前提[28]。伴隨基因測序及高通量測序技術的廣泛應用，研究發酵食品中的微生物組成及結構等內容將在食品研究領域中成為主流趨勢[29-31]，將對食醋行業發展起著重要推動作用。

4.1 PCR-DGGE 技術

該技術主要針對微生物多樣性和微生物群落進行分析。在酒曲、泡菜、乳制品等發酵食品中已被廣泛應用[32-34]，與其他高通量測序方法相比，該方法能直接提取DNA，具有分析速度快、能反映整個微生物群落等優點。Wei Xu 等人[35]通過該技術對鎮江香醋的發酵微生物動態變化趨勢進行分析。數據顯示，在發酵過程中主要以醋酸桿菌屬、乳酸桿菌屬等為主要細菌，以酵母菌屬為主要真菌。Li Pan 等人[36]對山西老陳醋細菌群落組成進行測序分析，研究發現乳桿菌和醋桿菌屬在醋酸發酵時期中具有較高占比。此外，歐文氏菌、假單胞菌、埃希氏菌、芽孢桿菌等在發酵過程中也占有一定比例。

4.2 RT-FQPCR 技術

RT-FQPCR 是對DNA 或RNA 序列進行實時擴增和檢測特定的測序技術。該測序技術利用熒光染料或探針，當與擴增的DNA 或RNA 分子結合時會發出信號，從而可以對目標序列進行量化。夏夢雷等人[37]對鎮江香醋醋酸發酵過程中菌種動態變化利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-FQPCR） 測序技術進行分析發現，酵母菌、乳酸菌及醋酸菌為醋醅中的優勢微生物，三者超過80%在真菌、細菌總占比中。

4.3 宏基因組技術

宏基因組測序是將樣品中的DNA 進行擴增、純化、片段化、連接到適當的適配器上，利用此技術進行測序。該技術針對測定的樣品基因，通常從樣品中直接提取，從而分析微生物之間的多樣性、種群結構、功能信息、與環境之間的關系，近年來在微生物學研究中得到了廣泛應用。劉愛平等人[38]對四川麩醋醅發酵過程中的菌種組成通過宏基因組測序進行研究。分析發現，金山乳桿菌、巴氏醋桿菌等在微生物種類中占據優勢比例，且這些優勢菌種同屬70 個門、885 個屬和3 168 個種。Wang Zongmin等人[39]對鎮江香醋宏基因組學和偏好分析，數據顯示，醋酸菌屬和乳酸菌屬在細菌中占有絕對優勢，曲霉屬和鏈格孢屬在真菌中占有絕大比例。

4.4 宏轉錄組學技術

宏轉錄組學是在轉錄水平，以特定樣本中微生物群落的全部轉錄本為研究對象，分析微生物群落的基因表達與調控。該技術沒有微生物的分離培養，為研究人員提供了研究的特定環境、特定時期微生物群落基因組轉錄情況以及轉錄調控規律的高效工具。Wu Yanfang 等人[40]通過宏轉錄組學對山西老陳醋中有機酸的代謝機制進行研究發現，乙酸、乳酸代謝來源與乳酸桿菌屬和醋酸桿菌屬有著直接關聯，而影響微生物代謝活性的環境因子主要是溫度、乙酸。

4.5 幾種測序方法優缺點比較

針對幾種測序方法優缺點進行了概括，如鑒定微生物的群落種類，PCR-DGGE 和RT-FQPCR 測序技術更適用，若對深入的生物學功能進行研究，宏基因組相關測序技術更適用。目前，隨著測序技術的不斷發展，檢測成本的減少，宏基因組有關的測序技術將會被廣泛應用，成為研究的主要趨勢。

測序方法優缺點比較見表1。

表1 測序方法優缺點比較

5 結語

綜上所述，發酵微生物在食醋的整個釀造過程起著關鍵作用，對食醋的出醋率及醋體品質有著重要影響，因此探索食醋發酵微生物的結構組成及發酵機理對控制食醋品質十分必要。目前，對傳統四大名醋的研究大多集中在微生物的組成剖析、菌種的分離篩選等方面，對發酵微生物背后的作用機制以及釀造機理的相關研究還較少，相信隨著人們對食醋研究的不斷深入、檢測方法的不斷發展完善，對四大名醋的發酵微生物研究內容將進一步擴展深入，為食醋企業生產提供理論依據和現實指導。