響應面法優(yōu)化瓜蔞皮中粗多糖提取工藝

吳 翔，徐雅芫，魏秀蘭尤逢惠

（1. 安徽省農業(yè)科學院農產品加工研究所，安徽 合肥 230036；2. 安徽黑娃食品生物科技有限公司，安徽 渦陽 233600）

亳州種植瓜蔞歷史悠久，曾是瓜蔞的主產地，這里產的天花粉被稱為“亳花粉”，是《中國藥典》中以“亳”字命名的中藥材之一，亳州地產藥材[1]。瓜蔞（Trichosanthes kirilowii），又稱栝樓，葫蘆科，屬多年生攀緣草本植物[2]。瓜蔞渾身是寶，皮、瓤、籽和根可以做中藥材，有清肺化痰、止咳平喘、潤腸通便等功效[3]。瓜蔞皮煎劑有較好的抑菌作用，研究表明對痢疾桿菌、肺炎球菌、溶血性鏈球菌及白喉桿菌均有效果[4]；對小白鼠免疫功能的提高效果明顯[5]。多個單糖分子縮合、失水即是多糖，糖類物質分子結構既復雜又龐大。多糖是構成生命的四大基本物質之一，大量存在于植物、微生物的細胞壁及動物細胞膜中，具有免疫調節(jié)、抗病毒和抗癌、降血糖、抗衰老、抗氧化、抗?jié)儯{節(jié)身體免疫力等多種作用[6]。以提高瓜蔞皮粗多糖的得率目標，采用Box-behnken 中心組合設計原理優(yōu)化提取工藝，為瓜蔞高值化、綜合利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

瓜蔞皮，安徽黑娃食品生物科技有限公司提供，產地為該公司基地，品種為皖蔞9 號；標準右旋葡萄糖，阿拉丁公司提供；無水乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸，均為國產試劑（分析純）；水，均為蒸餾水。

1.1.2 儀器與設備

UV-2800 型紫外分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司產品；RE-2000A 型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產品；DD-5M 型低速大容量離心機，湖南湘立科學儀器有限公司產品；FD-1D-50 型冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司產品；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司產品；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠產品；JJ124BC 型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠產品；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 瓜蔞皮粗多糖的提取

瓜蔞皮粗多糖提取采用水體醇沉法[7]，提取工藝為瓜蔞皮→洗凈→烘干→粉碎→提取→過濾→離心→濃縮→醇沉→過濾→凍干→粗多糖。

1.2.2 葡萄糖標準曲線繪制

分別精確吸取葡萄糖對照品溶液各0.2，0.6，1.0，1.4，1.8 mL，置于10 mL 容量瓶中，再加入50 g/L苯酚溶液0.5 mL 和濃硫酸溶液1.5 mL，置水浴（100 ℃） 保溫10 min，取出，室溫下放置冷卻，加蒸餾水至刻度。于波長490 nm 處測定吸光度（A），以質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，空白對照為蒸餾水。

1.2.3 瓜蔞皮粗多糖含量測定

采用苯酚- 硫酸比色法，對照品為葡萄糖，于波長490 nm 處測定多糖含量，該測定方法操作簡單、重復性好、結果準確可靠[8]。

準確稱取瓜蔞皮粗多糖樣品適量，用適量蒸餾水溶解于10 mL 容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度。準確吸取上述溶液1 mL 置于100 mL 容量瓶中加適量蒸餾水至刻度，制成約50 μg/mL 供試品溶液，即得。

1.2.4 單因素試驗

（1） 提取溫度對瓜蔞皮得率的影響。準確稱取瓜蔞皮50.00 g，采用料液比1∶20，提取時間2.5 h。分別在提取溫度50，60，70，80，90 ℃水浴下提取。用乙醇醇沉至含醇量為80%，靜置過夜后過濾取沉淀，冷凍干燥后得瓜蔞皮粗多糖，考查瓜蔞皮粗多糖得率。

（2） 提取時間對瓜蔞皮得率的影響。準確稱取瓜蔞皮50.00 g，采用料液比1∶20，提取溫度50 ℃。分別水浴提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h。用乙醇醇沉至含醇量為80%，靜置過夜后過濾取沉淀，冷凍干燥后得瓜蔞皮粗多糖，考查瓜蔞皮粗多糖得率。

（3） 料液比對瓜蔞皮得率的影響。準確稱取瓜蔞皮50.00 g，采用提取溫度50 ℃，提取時間2.5 h。分別采用料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 進行水浴。用乙醇醇沉至含醇量為80%，靜置過夜后過濾取沉淀，冷凍干燥后得瓜蔞皮粗多糖，考查瓜蔞皮粗多糖得率。

1.2.5 響應面法試驗設計安排

在單因素試驗結果基礎上，根據Box-behnken中心組合設計原理，選取提取溫度（A）、提取時間（B） 和料液比（C） 3 個因素為自變量，以瓜蔞皮粗多糖得率為響應值，進行三因素三水平響應面優(yōu)化組合。

響應面優(yōu)化試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面優(yōu)化試驗因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

于波長490 nm 處吸光度對葡萄糖質量濃度進行回歸處理，繪制出葡萄糖標準曲線，并由此得到回歸方程為Y=100.05X-0.003 3，R2=0.999 1。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取溫度對瓜蔞皮粗多糖得率的影響

提取溫度對粗多糖得率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對粗多糖得率的影響

由圖2 可知，提取溫度為50～90 ℃時，瓜蔞皮粗多糖得率先隨著溫度的升高而升高；當溫度升高到70 ℃時得率達到最高值，此后，得率隨溫度的升高反而降低。提取溫度的升高加速了瓜蔞皮中多糖的溶出，但當溫度升高至一定范圍內，瓜蔞皮中大量的其他物質也隨之溶出，導致溶液黏度增大，多糖溶出困難。當提取溫度過高時，部分糖苷鍵會發(fā)生斷裂而導致多糖變性。因此，當提取的其他條件一樣時，瓜蔞皮粗多糖提取的最適溫度為70 ℃。綜合考慮，選取60～80 ℃進行優(yōu)化試驗。

2.2.2 提取時間對瓜蔞皮粗多糖得率的影響

提取時間對粗多糖得率的影響見圖3。

圖3 提取時間對粗多糖得率的影響

由圖3 可知，當提取時間為0.5～2.5 h 時，提取時間的增長先會使瓜蔞皮粗多糖得率升高；在提取時間為2.5 h 時得率最高，之后提取時間增長反而使瓜蔞皮粗多糖提取率開始下降。發(fā)生這一變化的主要原因是提取時間過長時多糖發(fā)生分解變性；此外，溶液中的雜質也越來越多，溶液黏度過大而不利于多糖溶出。故當提取的其他條件一樣時，瓜蔞皮粗多糖提取的最佳時間為2.5 h。綜合考慮，選取2.0～3.0 h進行優(yōu)化試驗。

2.2.3 料液比對瓜蔞皮粗多糖得率的影響

料液比對粗多糖得率的影響見圖4。

圖4 料液比對粗多糖得率的影響

由圖4 可知，提取過程中隨著料液比的增大，瓜蔞皮粗多糖得率逐漸提高，當料液比為1∶25 時得率最高，料液比大于1∶25 時，瓜蔞皮粗多糖得率逐漸降低。可能是由于原料用量一定時，提取液量大時多糖比較容易從原料中溶出，從而使得得率升高。當提取液用量增大到一定程度時，相對質量濃度差增大率越來越低，對多糖得率的影響也越來越小。此外，考慮到溶劑用量越大雜質越多，生產成本越高，瓜蔞皮粗多糖提取的最佳料液比為1∶25。綜合考慮，選取料液比1∶20 ～1∶30 進行優(yōu)化試驗。

2.3 試驗模型的建立

根據單因素試驗確定單因素最佳水平，依表1進行3 個因素（提取溫度、提取時間、料液比） 與瓜蔞粗多糖得率之間的三因素三水平響應面法分析試驗，一共有17 個試驗點。

響應面試驗及結果見表2。

表2 響應面試驗及結果

2.4 模型方差分析

將表中數據通過Design Expert 8.06 軟件進行二次多元回歸擬合，以編碼自變量提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C） 擬合出以粗多糖得率（Y） 為考查指標的二次多項回歸方程：

響應面各因素效應的方差分析見表3。

根據方差分析結果，上述回歸模型中F=111.53，p＜0.000 1，表明試驗所采用的回歸模型差異極顯著；失擬項p 為0.68＞0.05，對模型是有利的，無失擬因素存在，該回歸方程可靠；回歸系數R2=0.993 1，大于85%，說明該回歸方程擬合程度好，可用該方程代替試驗真實點來描述各變量與響應值之間的關系。校正系數R2Adj=0.984 2，說明該模型可解釋98.42%粗多糖提取率的變化。表中數據說明試驗設計可靠，誤差小，符合實際情況[9-11]，故該回歸方程是瓜蔞皮粗多糖得率與提取工藝各參數擬合的較為合適數學模型。

由表3 可知，一次項A，B，C，二次項A2，B2，C2的p 值均小于0.01，說明A，B，C 和A2，B2，C2對粗多糖得率影響均極顯著；交互項AB，AC，BC的p 值均大于0.05，說明交互項對粗多糖得率影響均不顯著。根據表中F 值可得到3 個因素對粗多糖提取率影響程度為提取時間（B） ＞料液比（C） ＞提取溫度（A）。

2.5 響應面分析試驗結果

提取溫度與提取時間對多糖得率的交互影響見圖5，提取溫度與料液比對多糖得率的交互影響見圖6，提取時間與料液比對多糖得率的交互影響見圖7。

圖5 提取溫度與提取時間對多糖得率的交互影響

圖6 提取溫度與料液比對多糖得率的交互影響

圖7 提取時間與料液比對多糖得率的交互影響

通過Design Expert 8.06 軟件分析，結合回歸模型方差分析的結果，依據二次多項回歸方程式得出不同因子的響應面分析圖及響應等高線圖，就可觀察得出反映兩變量與因變量的關系，曲面坡度的陡峭程度，等高線的密集程度，可反映該試驗中的因變量對響應面的影響程度。若曲面坡度越平緩，則影響越小。等高線越接近橢圓形，2 個因素的交互作用越強；若等高線趨于圓形，則兩變量的交互作用幾乎可以忽略[12]。由圖5 ～圖7 比較可知，AC（即提取溫度和料液比） 的交互作用對瓜蔞皮粗多糖得率影響最大，BC（即提取時間和料液比） 的交互作用對得率影響次之，AB（即提取溫度和提取時間）的交互作用影響不顯著。

固定其中一個因素，考查另外2 個因素對響應值的影響。由圖5 可知，在料液比一定的情況下，隨著提取時間（B） 和提取溫度（A） 的增加，瓜蔞皮粗多糖得率均呈現出先升高再降低的變化趨勢。在提取溫度（A） 是66.8～74.4 ℃，提取時間（B）是2.3～2.9 h 時，瓜蔞皮粗多糖的得率在較高的范圍內。由圖6 可知，在提取時間（B） 一定的情況下，隨著提取溫度（A） 和料液比（C） 的增高，瓜蔞皮粗多糖得率呈現出先升高后降低的變化趨勢。在提取溫度（A） 是66.9～74.3 ℃，料液比（C） 是1∶22 ～1∶30 時，瓜蔞皮粗多糖得率相對較高。由圖7 可知，在提取溫度（A） 一定的情況下，隨著提取時間（B）和料液比（C） 的增加，瓜蔞皮粗多糖得率呈現先升高后降低的變化趨勢。當提取時間為2.3～2.9 h，料液比為1∶22 ～1∶30 時，瓜蔞皮粗多糖得率處于較高水平。

2.6 驗證試驗

采用Design Expert 8.06 軟件對二次多項回歸方程式進行求解，得到最佳的瓜蔞皮粗多糖提取條件為提取溫度（A） 70.52 ℃，提取時間（B） 2.62 h，料液比（C） 1∶26.45，此條件下，預測瓜蔞皮粗多糖得率為3.1449 5%。綜合考慮實際的操作可行性，并根據實驗室條件，將提取條件修正為提取溫度70 ℃，提取時間2.6 h，料液比1∶26，重復試驗3 次，此時瓜蔞皮粗多糖得率為3.11%，同模型預測值的相對誤差值為1.11%（＜5%），試驗結果與預測值基本符合。由此可知，響應面法所預測的瓜蔞皮粗多糖提取條件參數準確可靠，在實際應用中具有一定的價值[13]。

3 結論

通過單因素試驗確定試驗的因素和水平，采用Box-behnken 中心組合設計方法設計響應面試驗優(yōu)化確定了瓜蔞皮粗多糖的最優(yōu)提取工藝為提取溫度70 ℃，提取時間2.6 h，料液比1∶26，在此條件下瓜蔞皮粗多糖得率為3.11%。可為瓜蔞皮提取粗多糖的工藝研究提供一定的數據支持，為下一步提純多糖和其他理化檢測奠定了基礎。