滸苔多糖降解菌的篩選及其產(chǎn)物對(duì)黃豆種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響

耿 建，任召珍，叢懿潔，于佳弘，張玲俐

（1. 威海海洋職業(yè)學(xué)院，山東 威海 264300；2. 海洋經(jīng)濟(jì)藻類開發(fā)與利用工程技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 威海 264300）

0 引言

全球氣溫上升、海水富營(yíng)養(yǎng)化，導(dǎo)致滸苔在溫度合適時(shí)迅速生長(zhǎng)繁殖。2007 年以來，中國(guó)黃海連續(xù)15 年暴發(fā)以滸苔為肇事藻種的綠潮災(zāi)害，對(duì)該海域和沿岸地區(qū)的生態(tài)環(huán)境、濱海景觀、旅游和海水養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重影響。滸苔是歸屬于綠藻門、綠藻綱、石莼目、石莼科、石莼屬的一種大型藻類，滸苔在全球范圍內(nèi)有20 余亞種，分布較為廣泛。研究表明，滸苔細(xì)胞壁的主要成分是具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的滸苔多糖[1]，滸苔多糖作為滸苔的主要活性成分，具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和降血脂等，但是由于分子量比較大，滸苔多糖具有溶解性差、生物利用率低等缺陷，極大地限制了滸苔多糖資源的高值化開發(fā)和利用。滸苔多糖的化學(xué)組成較為復(fù)雜，齊曉輝[2]研究了來源于緣管滸苔、青島綠潮滸苔及廈門條滸苔的滸苔多糖的化學(xué)組成。研究發(fā)現(xiàn)，綠潮滸苔多糖主要由鼠李糖構(gòu)成，含有少量的半乳糖、木糖和葡萄糖醛酸；廈門條滸苔多糖則主要由阿拉伯糖和半乳糖組成；此外，還含有少量的鼠李糖和微量的巖藻糖、木糖、甘露糖和葡萄糖等成分；青島綠潮滸苔多糖則主要由鼠李糖組成，含有少量的葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖和甘露糖[3-5]。試驗(yàn)所用滸苔取自青島綠潮滸苔，從滸苔的附生菌中篩選出能夠高效降解滸苔多糖的菌株，研究了滸苔降解產(chǎn)物對(duì)黃豆種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料來源

滸苔，采自山東乳山銀灘區(qū)域；黃豆，普通市售黃豆種子。

1.1.2 培養(yǎng)基制備

（1） 富集培養(yǎng)基（g/100 mL）。滸苔10 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉1.5 g，維氏鹽溶液5 mL，pH 值7.0～7.5。（維氏鹽溶液：K2HPO4·3H2O 6.50 g，Mg-SO4·7H2O 2.50 g，NaCl 2.50 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·H2O 0.04 g，蒸餾水1 000 mL。）

（2） 分離培養(yǎng)基（g/100 mL）。蛋白胨0.5 g，酵母粉0.1 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉1.5 g，維氏鹽溶液5 mL，瓊脂1.5 g，pH 值7.0～7.5。

（3） 篩選培養(yǎng)基（g/100 mL）。滸苔多糖1.5 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉1.5 g，維氏鹽溶液5 mL，瓊脂1.5 g，pH 值7.0～7.5。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 滸苔多糖提取

準(zhǔn)確稱取100 g 干燥的滸苔進(jìn)行超微粉碎過篩，加入1 L 體積比1∶1 的二氯甲烷和丙酮混合溶液，抽濾后于65 ℃下干燥，使用3 L 蒸餾水熱水提取7 h，離心，取上清液。加入蛋白酶K 于37 ℃條件下反應(yīng)24 h，100 ℃下煮10 min，離心，取上清液。向上清液中加入 4 倍體積的95%的乙醇，置于4 ℃冰箱冷藏。將沉淀的滸苔多糖用丙酮洗滌，使用乙醇洗滌，最后進(jìn)行烘干，研磨。

1.2.2 菌株篩選

（1） 滸苔降解菌株富集。稱取10 g 新鮮滸苔，置于裝有90 mL 富集培養(yǎng)基的三角燒瓶中，于30 ℃條件下以轉(zhuǎn)速180 r/min 培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)液渾濁度及滸苔降解情況，培養(yǎng)3 d 后取10 mL 培養(yǎng)液于新的富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至渾濁。

（2） 菌株分離與篩選。將富集后的菌液梯度稀釋后涂布與分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h。選取菌落形態(tài)不同的菌進(jìn)行純化后點(diǎn)種與篩選培養(yǎng)基中，于30 ℃條件下培養(yǎng)48 h。利用高碘酸透明圈法篩選滸苔多糖降解菌。

1.2.3 菌株鑒定

（1） 形態(tài)學(xué)鑒定。采用平板劃線法將菌株接種到LB 固體培養(yǎng)基中，于30 ℃條件下培養(yǎng)48 h 后觀察菌落形態(tài)；將其進(jìn)行革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

（2） 分子生物學(xué)鑒定。采用Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒提取DNA，采用通用引物，上游引物7F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'），下游引物1540R（5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'），以菌液DNA 為模板，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。將上述的PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收后，送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，使用NCBI 在線軟件BLAST 與已知微生物的16S rDNA 進(jìn)行相似性分析。

1.2.4 大豆種子萌發(fā)及生長(zhǎng)測(cè)定

（1） 滸苔多糖降解液制備。將菌株接種于含有1.5%滸苔多糖的培養(yǎng)液中，于30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，然后用0.22 μm 濾膜過濾除菌，去除菌株菌體，得到滸苔多糖降解液。

（2） 試驗(yàn)分組。試驗(yàn)采取隨機(jī)組設(shè)計(jì)，每組30 粒種子，重復(fù)3 次，設(shè)計(jì)9 個(gè)處理。處理1：滸苔多糖發(fā)酵液原液；處理2：滸苔多糖發(fā)酵液清水稀釋100 倍；處理3：滸苔多糖發(fā)酵液清水稀釋500 倍；處理4：滸苔多糖發(fā)酵液清水稀釋1 000 倍；處理5：1.5%的滸苔多糖液；處理6：1.5%的滸苔多糖液清水稀釋100 倍；處理7：1.5%的滸苔多糖液清水稀釋500 倍；處理8：1.5%的滸苔多糖液清水稀釋1 000 倍；處理9：清水對(duì)照。

（3） 種子生物特性測(cè)定。將種子放入清水中浸泡過夜，挑選大小相似的種子隨機(jī)分9 組，放入墊有紗布的托盤中，每天噴灑處理液2 次，48 h 后計(jì)算發(fā)芽率，5 d 后測(cè)量種子芽長(zhǎng)及干質(zhì)量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft excel 對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

滸苔附生菌經(jīng)過富集后，在分離培養(yǎng)基中得到8 株不同的菌株，將其點(diǎn)種與篩選培養(yǎng)基中，只得到2 個(gè)菌株，經(jīng)過高碘酸透明圈法篩選只有1 株菌株出現(xiàn)了明顯的透明圈，且透明圈直徑超過2 cm。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

在LB 固體培養(yǎng)基上可觀察到，菌落呈乳白色，不透明，圓形邊緣有缺刻，直徑大概1 mm，表面光滑濕潤(rùn)。經(jīng)革蘭氏染色可以看出該菌株為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，形態(tài)呈弧狀，單個(gè)排列。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)過PCR 擴(kuò)增后，菌株16SrDNA長(zhǎng)度為1 450 bp，經(jīng)過blast 對(duì)比發(fā)現(xiàn)該菌株與Vibrio diabolicus 相似度達(dá)到99.66%，推測(cè)該菌株為Vibrio diabolicus（魔鬼弧菌）。

2.3 滸苔多糖降解產(chǎn)物對(duì)黃豆種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響

2.3.1 不同滸苔多糖降解液對(duì)種子萌發(fā)的影響

滸苔多糖降解產(chǎn)物對(duì)黃豆種子發(fā)芽率的影響見圖1。

圖1 滸苔多糖降解產(chǎn)物對(duì)黃豆種子發(fā)芽率的影響

由圖1 可知，處理1 和處理5 其發(fā)芽率較處理9（對(duì)照組） 低8.9%，其他處理組黃豆種子發(fā)芽率與對(duì)照組比沒有顯著差別。說明高濃度滸苔多糖培養(yǎng)液不利于黃豆種子發(fā)芽，低濃度的滸苔多糖對(duì)種子發(fā)芽率影響不大。

2.3.2 不同滸苔多糖降解液對(duì)黃豆種子芽長(zhǎng)增長(zhǎng)的影響

滸苔多糖降解液對(duì)黃豆種子芽長(zhǎng)增長(zhǎng)的影響見圖2。

圖2 滸苔多糖降解液對(duì)黃豆種子芽長(zhǎng)增長(zhǎng)的影響

由圖2 可知，處理6 的芽長(zhǎng)較處理9（對(duì)照組）長(zhǎng)8.0%，處理組2 的芽長(zhǎng)較處理9（對(duì)照組） 長(zhǎng)4.8%。說明適宜濃度的滸苔多糖和滸苔多糖降解液均能夠促進(jìn)黃豆種子芽的生長(zhǎng)，滸苔多糖降解后促進(jìn)作用更加明顯。

2.3.3 不同滸苔多糖降解液對(duì)種子生長(zhǎng)量的影響

對(duì)種子生長(zhǎng)量的影響見圖3。

圖3 滸苔多糖降解液對(duì)種子生長(zhǎng)量的影響

由圖3 可知，處理7 的種子干質(zhì)量較處理9（對(duì)照組） 增長(zhǎng)22.7%，處理6 的種子干質(zhì)量較處理9（對(duì)照組） 增長(zhǎng)18.2%。處理組1～4 的種子干質(zhì)量與處理9（對(duì)照組） 差距不明顯。說明滸苔多糖不能被黃豆種子很好地利用，但被降解后的滸苔多糖能夠被黃豆種子較好地吸收利用。

3 結(jié)論

滸苔這一藻類資源非常豐富，滸苔中滸苔多糖的含量高達(dá)50%，滸苔多糖具有降血糖、提高免疫力、抗腫瘤等多種生物活性，由于其多糖分子量較大，滸苔多糖在應(yīng)用方面受到了極大的限制。將大分子的滸苔多糖降解為低分子量的寡糖是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前，將大分子的滸苔多糖降解為小分子的糖的方法主要有物理法、化學(xué)法、酶法。化學(xué)法降解滸苔多糖，高玉杰等人[4]利用三氟乙酸（TFA）對(duì)滸苔多糖進(jìn)行降解，用于制備低分子量的滸苔多糖。有研究利用TFA 和硝酸對(duì)滸苔多糖進(jìn)行降解，并對(duì)降解的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。物理法降解滸苔多糖，由于物理法降解多糖的條件較為劇烈，可能會(huì)對(duì)寡糖的結(jié)構(gòu)造成破壞。Li Bing 等人[5]利用微波輔助的方法降解滸苔多糖，由于微波作用的非特異性，降解得到的產(chǎn)物分子量分布差異較大，從3.1 kU 到446.5 kU 均有分布。酶降解法是利用酶作為一種特殊的生物催化劑，具有較強(qiáng)的底物和產(chǎn)物專一性，可選擇性酶解特定的糖苷鍵得到特定寡聚糖，還不造成環(huán)境污染，因此尋找一種活力高、穩(wěn)定性強(qiáng)的海藻多糖降解酶成為了目前滸苔利用性研究的熱點(diǎn)。試驗(yàn)從滸苔附生菌中篩選出一株能夠高效降解滸苔多糖的菌株，經(jīng)分子學(xué)鑒定推測(cè)該菌株為Vibrio diabolicus。通過不同濃度的滸苔多糖降解液處理黃豆種子發(fā)現(xiàn)適宜濃度滸苔多糖降解液對(duì)促進(jìn)黃豆種子生長(zhǎng)有明顯作用，而對(duì)種子萌發(fā)作用不明顯。高濃度滸苔多糖培養(yǎng)液會(huì)抑制黃豆種子萌發(fā)及生長(zhǎng)，所以在滸苔多糖降解液的應(yīng)用中應(yīng)注意濃度適宜。