水族藥南燭根對脛骨骨折大鼠模型血管生成作用的實驗研究

曾升友 梁子聰 陸瑞娜 劉 琦 張樂少雄

1.貴州省羅甸縣中醫醫院，貴州 羅甸 550100；2.黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558000；3.黔南州人民醫院，貴州 都勻 558000

隨著國家人口的老齡化和工業交通運輸業的發展，臨床上骨折的發病率越來越高[1]。豐富的血液供應是骨折愈合的基礎，而VEGF是促進血管新生的關鍵因子[2]。南燭根是杜鵑花科植物烏飯樹VacciniumbracteatumThunb.的根[3]，水族民間常將其用于治療骨折，但其促進骨折愈合的作用機制至今尚未明確。本課題建立脛骨骨折大鼠模型，觀察水族藥南燭根對骨折大鼠的血管生成作用，探討其對骨折的治療作用，為揭示其作用機制提供理論基礎。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠(清潔級)60只，體重200～220g，雄性。每組分籠適應飼養1周，期間飲水、喂食正常進行，購于湖南長沙天勤生物技術有限公司[動物許可證號SCXK(湘)2019-0014]。

1.2 藥材與試劑 水藥南燭根中藥飲片采自貴州三都水族自治縣內，經黔南民族醫學高等專科學校第二附屬醫院民族醫學科教授胡建山鑒定為杜鵑花科植物烏飯樹VacciniumbracteatumThunb.的根。蘇木精伊紅液、Masson染液(上海碧云天公司)，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管內皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2)免疫組化抗體試劑盒(北京中杉金橋公司)。接骨七厘片(國藥準字Z20003140，湖南金沙藥業有限公司)，其他均為國產分析純。

2 方法

2.1 南燭根水提液制備 將南燭根碾碎，以10倍超純水浸泡0.5 h，煎鍋煎煮1.5 h，重復提取2次，混合藥液旋蒸儀濃縮至濃度1.5 g/mL，存放 4 ℃ 冰箱備用。

2.2 模型建立及分組 采用鋸開法建立大鼠脛骨干骨折模型。所有SD大鼠均以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，以平臥位固定于造模臺。碘伏消毒左足至左大腿上段，于脛骨結節下方2 mm沿脛骨脊作1.5 cm縱向切口，剝離外皮，繼續沿脛骨脊外側0.5 mm位置將淺筋膜與深筋膜層縱向切開，游離脛骨前肌群，暴露脛骨外骨面。采用5 mL注射器針頭于脛骨髕韌帶開口，插入克氏針沿髓腔達脛骨粗隆間，于脛骨中段前方最高點鋸開約3 mm左右缺損，缺損達骨髓腔，形成脛骨中段橫行骨折。繼續插入克氏針穿過骨折位置貫穿整個脛骨髓腔，固定骨折，剪除多余克氏針，將其遠端埋于骨皮質下。以0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后逐層縫合切口，涂抹適量紅霉素軟膏，連續3 d每天注射8萬U青霉素以預防感染。成功建立大鼠脛骨骨折模型后，將大鼠隨機分成假手術組、模型對照組，陽性對照組(接骨七厘片 20 mg/kg)、南燭根水提液高、中、低劑量組(400 mg/kg，200 mg/kg，100 mg/kg)，每組10只。建模后第2天起，各給藥組按照相應劑量配置溶液灌胃，每天2次。假手術組和模型對照組不給予藥物，正常飲食。連續2周。

2.3 鏡下病理及血管新生情況觀察 處死大鼠后，以骨折位置作為中心，上下各取5 mm×5 mm骨痂組織標本，以4%多聚甲醛固定24 h，組織塊常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制作成厚度5 μm的切片，脫蠟后Masson染色，光鏡下拍照，采用Image ProPlus Software 6.0 IPP軟件測定新生血管面積百分比(血管面積/截圖面積)，在骨痂愈合平面單位視野內隨機選取10個不相鄰視野，計算每個視野平均值。

2.4 免疫組化法檢測骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達量 切片常規脫蠟復水后，微波修復，3%H2O2滅活內源性過氧化酶，BSA封閉滴加一抗(VEGF 1∶400，VEGFR-2 1∶400)4 ℃過夜，次日37 ℃復溫漂洗后二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復染，經脫水透明后封片，應用image pro圖像軟件測定骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達量。

2.5 統計學分析 應用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數加減標準差表示，多樣本資料組間比較采用單因素方差分析及重復測量方差分析，經Levene檢驗滿足方差齊性者，采用單因素方差分析，以最小顯著性差異LSD-t檢驗行兩兩比較；方差不齊者，采用Welch檢驗，再以Dunnett T3檢驗進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠骨痂鏡下病理觀察和血管面積測定結果的比較 假手術組大鼠脛骨骨髓腔內見骨小梁大小、粗細、間隔均勻一致，骨小梁間隔中可見散在血管穿過。與假手術組比較，模型對照組大鼠脛骨骨痂內可見大量的成熟軟骨細胞，有豐富的新生微血管，骨小梁較粗、大小不均。與模型對照組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組鏡下表現相似，而陽性對照組和南燭根水提液高劑量組軟骨細胞更加成熟，骨小梁粗大、密集，骨小梁間隔可見豐富的血管。如圖1。與假手術組比較，模型對照組、陽性對照組、南燭根水提液低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠骨痂血管面積百分比顯著增高(P<0.05)；與模型對照組比較，陽性對照組、南燭根水提液高劑量組大鼠骨痂血管面積百分比顯著增高(P<0.05)；與陽性對照組、南燭根水提液高劑量組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組骨痂血管面積百分比明顯降低(P<0.05)。詳見表1。

A.假手術組；B.模型對照組；C.陽性對照組；D.南燭根低劑量組；E.南燭根中劑量組；F.南燭根高劑量組

表1 大鼠脛骨骨痂血管面積百分比和VEGF、VEGFR-2免疫組化陽性表達結果

3.2 大鼠脛骨骨痂VEGF、VEGFR-2免疫組化陽性表達結果的比較 與假手術組比較，模型對照組、陽性對照組、南燭根水提液低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠骨痂VEGF、VEGFR-2陽性表達顯著增高(P<0.05)；與模型對照組比較，陽性對照組、南燭根水提液高劑量組大鼠骨痂VEGF、VEGFR-2陽性表達顯著增高(P<0.05)；與陽性對照組、南燭根水提液高劑量組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組骨痂VEGF陽性表達明顯降低(P<0.05)；與陽性對照組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組、高劑量組骨痂VEGFR-2陽性表達明顯降低(P<0.05)。如圖1、圖2、圖3所示。

A.假手術組；B.模型對照組；C.陽性對照組；D.南燭根低劑量組；E.南燭根中劑量組；F.南燭根高劑量組

A.假手術組；B.模型對照組；C.陽性對照組；D.南燭根低劑量組；E.南燭根中劑量組；F.南燭根高劑量組

4 討論

骨折是臨床上骨科最常見的疾病之一。骨折愈合的速度決定了患者回歸正常生活的時間，如何促進骨折快速愈合是臨床醫師共同面對的難題。骨折愈合是一個極其復雜的過程，骨折的早期階段由間充質干細胞聚集于骨折斷端，然后其可分化為纖維細胞、成骨細胞以及原始軟骨細胞，是最早骨細胞的來源，促進成骨反應[4]。通過成骨細胞的骨膜成骨和軟骨細胞的骨化形成原始骨組織，然后產生軟骨基質和無機鹽沉淀礦化成骨[5]。新生血管的形成和豐富的血液供應是許多細胞發揮其生長和修復功能的重要因素[6]。研究[7]證明，VEGF可以促進內皮細胞分裂，增加血管通透性，抑制內皮細胞凋亡，促進血管新生。VEGFR-2是VEGF的特異性抗體，兩者結合可以誘導新的血管生成。研究顯示，通過拮抗劑競爭性與VEGFR結合，從而抑制了VEGF活性，引起小鼠股骨骨折模型愈合障礙[8]。動物骨折模型可以分為開放性和閉合性造模，開放性骨折模型主要是采用切開皮膚及皮下組織后，使用手鋸或者側刀切斷骨組織造成骨折，然后根據實驗需要固定或者不固定骨折處[9]。閉合性模型大部分使用固定裝置固定造模側肢體，然后利用重物撞擊患肢，使得患肢形成骨折，而不破壞皮膚[10]。實驗主要觀察骨痂處軟骨細胞生長及組織因子表達程度，閉合性骨折模型由于動物的體位、肢體固定的角度造成重物下墜時難以控制骨折后形成面積，可能對實驗結果造成較大誤差，因此本實驗選擇了鋸開法制造大鼠脛骨干動物模型。

南燭根是杜鵑花科植物烏飯樹的根，主要分布于貴州、湖南、江西等地，歸肝經、腎經，其主要治療功效為散瘀消腫、強筋止痛。南方民眾早有將南燭葉的浸汁做成烏米飯食用，但南燭根用藥的報道較少。水族民間常用南燭根熬成藥汁用于治療骨折，療效明顯。研究顯示，南燭根浸出物中富含分槲皮素、山柰酚、芹菜素和木犀草素等活性成分[11]。多個動物實驗研究結果顯示，槲皮素可通過多條信號通路促進BMSCs的增殖和成骨細胞分化，達到抗骨質疏松癥和促進骨折愈合的作用[12-14]。本研究結果顯示，與模型對照組比較，陽性對照組、南燭根水提液高劑量組大鼠骨痂血管面積百分比和大鼠骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達顯著增高；鏡下病理結果顯示，陽性對照組和南燭根水提液高劑量組軟骨細胞更加成熟，骨小梁粗大、密集，骨小梁間隔可見豐富的血管。由此說明，南燭根水提液可以通過提高VEGF、VEGFR-2的表達，促進內皮細胞的增生，增加新生血管的數量，從而加速骨折端的愈合。實驗中，南燭根水提液低劑量組和中劑量組與模型對照組在血管面積、骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達等方面未見明顯差異，說明當南燭根水提液達到400 mg/kg可明顯促進骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達，從而起到治療作用。

綜上所述，水族民間常用南燭根治療骨折，但由于基礎研究和臨床報道較少，因此未被廣泛應用。經實驗研究發現，南燭根水提液可明顯促進骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達，內皮細胞分裂，促進血管新生，從而達到促進骨折愈合的作用。本實驗僅揭示了南燭根通過提高VEGF、VEGFR-2表達的作用，南燭根的其他作用途徑仍需下一部實驗證實。