舒血寧注射劑中活性成分含量檢測及其指紋圖譜優化研究

羅祥敏 許成艷 雷 芳 何 珺*

(1. 貴州中醫藥大學時珍學院,貴州 貴陽 550025;2. 貴州大學 藥學院,貴州 貴陽 550025)

銀杏葉提取物(Ginkgobilobaextract, GBE)為銀杏科植物銀杏的干燥葉經過醇提取[1]、柱層析分離純化得到的提取物,廣泛應用于醫藥、保健品、食品和化妝品等領域,是現代植物藥(中成藥)開發應用最成功的案例之一[2]。黃酮和萜內酯類化合物被視為銀杏葉提取物中的主要活性成分[3-9],具有抗氧化、抗炎、抗應激、保肝和免疫調節等多種有益功能[10]。銀杏葉提取物亦常作為神經系統藥物使用,廣泛應用于治療心腦血管疾病[11],被認為是治療心血管疾病和神經系統疾病的雙跨性藥物[12-14],并具有緩解老年人群認知障礙[15]、延緩腎間質纖維化[16]的作用。在畜禽養殖中,GBE作為飼料添加劑已被廣泛報道[17-18]。

舒血寧注射液是銀杏葉提取物制成的滅菌水溶液。藥理學研究表明舒血寧注射劑具有擴張血管、改善微循環的作用[19],同時具有抗腦血管痙攣、抗氧化、抗血栓、降低血黏度、提高免疫力等作用[20]。杜賢蘭等[21]、吳俊蘭等[22]研究發現舒血寧注射劑對心腦血管疾病當中的腦梗死具有療效,周宜強[23]、張琳鈞等[24]研究發現舒血寧注射劑對糖尿病周圍神經病變患者具有較好的療效。《2009—2011年全國城鎮基本醫療保險參保住院患者中藥利用情況分析》報告顯示,舒血寧注射液在內科用藥中排位第一,費用高達24.93億元,可見舒血寧注射劑的臨床需求大,確保舒血寧注射劑的安全性和有效性顯得尤為重要。

中藥組成成分復雜,只用單一活性成分來闡述中藥質量不夠全面。中藥指紋圖譜技術是中藥實現現代化、國際化的關鍵,成為中藥質量標準研究的核心技術[25]。它從整體上體現中藥中成分的種類和數量,反映中藥的內在質量[25]。2020版藥典要求銀杏葉提取物在檢測波長360 nm條件下有17個特征峰[26]。舒血寧是一個以注射用銀杏葉提取物為藥理作用物質的多成分中藥注射劑,黃酮醇苷類和萜內酯類被視為舒血寧注射劑的主要活性物質,但中藥提取物是一個復雜的體系,藥理作用不僅僅是單一物質的作用,而且是多種物質共同產生的藥理作用,課題組前期通過網絡藥理學預測了銀杏葉提取物中活性成分,本研究對舒血寧注射劑組成成分進行驗證及含量測定,同時對舒血寧注射劑的指紋圖譜進行了完善和優化,對舒血寧注射劑的質量安全及功效穩定性研究具有一定意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

實驗設備,所用標準對照表及測試樣品分別如表1、表2、表3所示。

表1 實驗設備及其來源Tab. 1 Equipment and its source

表2 對照品及其來源Tab. 2 Reference substance and its source

表3 供試品及其來源Tab. 3 Test products and their sources

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

依據藥典及文獻結果,各可能存在活性成分及對應的測定色譜條件如表4所示。

表4 活性成分及其色譜條件Tab. 4 Active ingredients and their chromatographic conditions

指紋圖譜色譜條件[26]:柱溫為30 ℃;檢測波長360、234、250、280、324 nm;C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm),流速為1.0 mL·min-1;流動相:乙腈(A)、0.4%磷酸水(B)[26]按表5梯度進行洗脫。

表5 舒血寧注射劑的指紋圖譜梯度洗脫Tab. 5 Gradientelution of fingerprint of shuxuening injection

1.2.2 對照品溶液的制備

(1) 精密稱取槲皮素、山柰素、異鼠李素適量置于100 mL容量瓶中,加甲醇將其配制成每1 mL含槲皮素30 μg、山柰素30 μg、異鼠李素20 μg的混合溶液[27],過0.45 μm濾膜,備用。

(2) 精密稱取銀杏內酯C、白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B標準品適量放置于100 mL容量瓶中,加50%甲醇溶液,配制成每1 mL含銀杏內酯C 0.10 mg、白果內酯0.20 mg、銀杏內酯A 0.18 mg、銀杏內酯B 0.08 mg的混合溶液[27],用0.45 μm濾膜過濾。

(3) 分別精密稱取綠原酸、莽草酸標準品適量置100 mL容量瓶中,加10%甲醇配制成0.315 mg·mL-1綠原酸標準品溶液和0.220 mg·mL-1莽草酸標準品溶液[27]。

(4) 精密稱取兒茶素、表兒茶素、葛根素、圣草酚、木犀草素、香葉木素、大麥芽堿、芫花素、β-谷甾醇、芝麻素標準品適量于具塞10 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,得到濃度為0.234、0.246、0.154、 0.502、0.500、0.238、0.194、0.129、0.245、0.217 mg·mL-1的標準品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

(1) 精密稱取不同來源的銀杏葉提取物適量,用55%甲醇溶液定容至10 mL,超聲溶解,過0.45 μm膜。

(2) 測木犀草素供試品溶液的制備:精密稱取銀杏葉提取物35 mg,加入10 mL固體水解液(甲醇∶純水∶濃鹽酸=7∶2∶1),置于68 ℃水浴鍋中水解3 h[28],取出冷卻至室溫,0.45 μm膜過濾即得。

(3) 注射用銀杏葉提取物供試品的制備:精密稱取注射用銀杏葉提取物35 mg,加10 mL 15%乙腈溶液,超聲1 min,搖勻,經0.45 μm微孔過濾膜過濾,即得注射用銀杏葉提取物供試品[28]。

(4) 舒血寧注射劑供試品的制備:取1支舒血寧注射劑,打破外玻璃容器,取出內容物,經0.45 μm微孔過濾膜過濾,即得舒血寧注射劑供試品。

1.2.4 數據處理

將銀杏葉提取物對照品、銀杏葉提取物供試品等色譜圖數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度計算軟件,進行主峰匹配。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度

精密稱取1.2.2中銀杏內酯A、槲皮素、兒茶素各1個對照品溶液,按1.2.1節的色譜條件分別進樣檢測6次,根據峰面積計算相對標準偏差(RSD)值。銀杏內酯A的RSD為0.85%,槲皮素的RSD為0.77%,兒茶素的RSD為0.69%,表明該測定方法精密度良好。

2.1.2 穩定性

精密稱取1.2.3的注射用銀杏葉提取物供試品溶液,分別在室溫條件下放置4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h,按1.2.1的色譜條件分別進樣檢測,總黃酮RSD為0.98%,總萜內酯RSD為1.02%,莽草酸RSD為1.11%,綠原酸RSD為0.89%,兒茶素RSD為0.96%,表明樣品在48 h內穩定性良好。

2.1.3 重復性

精密稱取1.2.3的注射用銀杏葉提取物4份,按供試品制備方法分別制備成供試品溶液,分別按1.2.1的色譜條件進樣檢測,記錄峰面積,計算RSD均小于1.4%,表明該方法的重復性良好。

2.2 舒血寧注射劑用銀杏葉提取物中活性成分含量測定結果

將對照品和供試品按1.2.1色譜條件進樣檢測,結果見表6～表8。

表7 注射用銀杏葉提取物中活性化合物含量測定結果(2)Tab. 7 Validation results of active compounds in ginkgo biloba extract for injection (2)

表8 注射用銀杏葉提取物中活性化合物含量測定結果(3)Tab. 8 Validation results of active compounds in ginkgo biloba extract for injection (3)

6批次注射用銀杏葉提取物中結構明確的活性化合物含量之和為60.52%～67.33%,均大于總固體量的60%。6批次注射用銀杏葉提取物均不含芫花素、芝麻素及β-谷甾醇。不同廠家的注射用銀杏葉提取物中總黃酮、總內酯、兒茶素、表兒茶素、葛根素、圣草酚及綠原酸含量不一樣,這可能與生產過程中的工藝參數和操作不同有關。供試品中莽草酸、香葉木素色譜圖參見圖1和圖2。

圖1 供試品中莽草酸色譜分析圖Fig. 1 Chromatographic analysis of shikimic acid in tested products

圖2 供試品中香葉木素色譜分析圖Fig. 2 Chromatographic analysis of diosmetin in tested products

2.3 舒血寧注射劑指紋圖譜完善結果

將樣品按表2中兒茶素測試的色譜條件進樣測定,然后把色譜圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度計算軟件,與對照銀杏葉提取物進行主峰匹配如圖3所示,結果顯示檢測波長為280 nm,兒茶素在指紋圖譜中定位T=8.146 min出峰。同樣方法可得檢測波長為280 nm,表兒茶素在指紋圖譜中定位T=11.594 min出峰;檢測波長為250 nm,葛根素在指紋圖譜中定位T=8.814 min出峰;檢測波長為360 nm,香葉木素在指紋圖譜中定位T=73.202 min出峰;檢測波長為324 nm,綠原酸在指紋圖譜中定位T=7.707 min出峰;檢測波長為234 nm,莽草酸在指紋圖譜中定位T=2.601 min出峰。其中兒茶素指紋圖譜比對如圖3所示,其余各物質比對方法相同不再贅述。

圖3 兒茶素在銀杏葉提取物指紋圖譜中的定位(λ=280 nm)Fig. 3 Localization of catechin in fingerprint of ginkgo biloba extract (λ=280 nm)

在2020年版藥典測定銀杏葉提取物指紋圖譜方法基礎上,在舒血寧注射劑指紋圖譜中定位到6個新化合物,分別是兒茶素、表兒茶素、葛根素、香葉木素、綠原酸、莽草酸。

3 結論

采用HPLC法對注射用銀杏葉提取物中的總黃酮、總萜內酯、兒茶素、表兒茶素、葛根素、圣草酚、香葉木素、大麥芽堿、芫花素、芝麻素、β-谷甾醇、綠原酸、莽草酸、木犀草素等具體活性化合物進行含量測定。結果顯示,6批次注射用銀杏葉提取物中結構明確的活性化合物含量之和均大于總固體量的60%,均不含芫花素、芝麻素及β谷甾醇。在2020年版藥典測定銀杏葉提取物指紋圖譜方法基礎上,對舒血寧注射劑指紋圖譜進行了優化,在舒血寧注射劑指紋圖譜中定位到了6個新化合物,分別是兒茶素、表兒茶素、葛根素、香葉木素、綠原酸及莽草酸,豐富了舒血寧注射劑的指紋圖譜。本研究驗證了舒血寧注射劑的組成成分非常復雜,其擴張血管、改善微循環等藥理作用應是這些活性成分共同作用的結果。