波齊替尼合成工藝研究

袁 昕 焦小雨 唐春雷

(江南大學 生命科學與健康工程學院,江蘇 無錫 214122)

波尼替尼(Poziotinib,1),化學名1-(4-(4-(3,4-二氯-2-氟苯胺)-7-甲氧基喹唑啉-6-氧基)-1-哌啶基)丙-2-烯-1-酮(圖1),是由韓國首爾醫科大學于2008年研發的一種泛人表皮生長因子受體2(EGFR2)酪氨酸激酶抑制劑[1],主要靶向EGFR野生型、EGFRT790M/L858R、HER2和HER4,對應的IC50分別為3.2、2.2、5.3和23.5 nmol·L-1[2]。據數據顯示,目前非小細胞肺癌(NSCLC)患者中90%的HER2突變是20號外顯子突變,4%的患者中存在EGFR和HER2的20號外顯子雙突變[3]。然而由于20號外顯子的突變改變了藥物結合口袋的大小、限制了大的剛性抑制劑的結合,目前已有的許多酪氨酸激酶抑制劑,如阿法替尼[4]、達克米替尼、來那替尼[5]等,對EGFR和HER2的20號外顯子突變抑制效果不佳。因此針對EGFR和HER2的20號外顯子雙突變的NSCLC患者依舊缺乏有效的治療方法。而Poziotinib由于結構較小、存在可靈活旋轉結構的特點,可以規避空間位阻變化[3],給患者帶來良好的治療效果。根據最新的Ⅱ臨床試驗數據(NCT03066206),Poziotinib在EGFR和HER2的20號外顯子突變的NSCLC中獲得了30%的客觀緩解率[6],有望成為具有良好治療效果的酪氨酸激酶抑制劑。作者對Poziotinib的合成方法進行了研究,以期為該化合物的合成以及結構類似物的研究提供理論參考。

1圖1 Poziotinib的結構Fig. 1 The structure of Poziotinib

1 合成路線

目前原研公司報道的Poziotinib(1)的合成路線如圖2所示[7,8],以2-氨基-4,5-二甲氧基苯甲酸(2)為原料在210 ℃下與鹽酸甲脒反應得到6,7-二甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮(3)。化合物3在甲磺酸中與甲硫氨酸反應得到6-羥基-7-甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮(4)。化合物4在吡啶和無水乙酸中乙酰化生成關鍵中間體3,4-二氫-7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸酯(5)。化合物5與三氯氧磷在甲苯中經氯化得到4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-乙酸酯(6)。化合物6在含氨水的甲醇溶液中去乙酰化得到4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-醇(7)。化合物7與4-(甲苯-4-磺酰氧)哌啶-1-羧酸叔丁酯(11)經Mitsunobu反應得到4-((4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(8)。化合物8在乙腈溶液中與3,4-二氯-2-氟苯胺(12)經取代反應得到4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(9)。化合物9以丙酮作為溶劑通過鹽酸脫去叔丁基羰基(Boc)的保護得到N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基-6-(哌啶-4-氧基)喹唑啉-4-胺(10)。化合物10在碳酸氫鈉的四氫呋喃和水的混合溶液中與丙烯酰氯經酰化反應得到Poziotinib (1),總收率12.7%(以2計,以5計收率為32.0%)。該路線操作復雜、反應耗時長、副產物多、成本較高,不利于工業化生產。

圖2 化合物1的原研合成路線Fig. 2 Original synthetic route of compound 1 in Literature

原研專利合成路線共有9步,經成本核算,其中經1～3步得到化合物5所需成本高于直接商業化獲得化合物5的價格。化合物2至化合物4的制備步驟危險性較大。這幾步反應均在無溶劑且高溫的情況下進行,反應可能不均勻,且氯代后的產物6往往結構不穩定,暴露在空氣中容易與空氣中的水發生取代反應變回氯取代前的原料。故改進工藝路線(如圖3所示)中6優先與3,4-二氯-2-氟苯胺(12)進行親核取代反應,有效解決了化合物穩定性低的問題,相比原研路線,收率也得到了保證。改進后的工藝路線以廉價易得的7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸酯(5)為起始原料,經6步反應得到Poziotinb,且收率由原來的12.7%提高至42.3%(以5計)。另外,改進路線在關鍵中間體9和Poziotinib(1)粗品的純化上采用重結晶的方式,節約了時間和溶劑成本。優化后的工藝路線在提高總收率的前提下,降低了生產成本和能耗,反應條件相對溫和,后處理操作簡便,適合工業化大量制備。

圖3 化合物1的改進合成路線Fig. 3 Improved synthetic route of compound 1

2 實驗部分

2.1 主要儀器與試劑

7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸酯(5),97%;4-(甲苯-4-磺酰氧)哌啶-1-羧酸叔丁酯(11),98%;3,4-二氯-2-氟苯胺(12),98%。以上試劑均購于上海畢得醫藥有限公司。實驗所用試劑均為市售分析純或化學純,未經進一步純化處理。TLC展開劑和溶劑比例均為體積比。

液相-質譜儀,LC-MS-80,Waters公司,ESI離子源,正離子MS模式,離子源溫度120 ℃,錐孔電壓40 V,碰撞能量20 eV,全掃描質荷比為50～1 500 Da,掃描時間為0.5 s。液相色譜儀,LC1260,安捷倫科技有限公司。核磁共振儀,Bruker AVII-400 MHz,德國Bruker公司,TMS為內標。

2.2 合成步驟

2.2.1 4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-乙酸酯(6)

將7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸酯(5)(30.0 g,128.1 mmol)和氯化亞砜(300 mL)置于1 000 mL反應瓶中,隨后加入催化量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF,0.15 g),80 ℃攪拌反應2 h,TLC檢測反應(展開劑:石油醚-乙酸乙酯,體積比1∶1),減壓蒸除溶劑后,冰浴下向殘留物中緩慢滴加飽和碳酸氫鈉水溶液,調pH值至8～9,用二氯甲烷(3×500 mL)萃取,合并有機相,有機相水洗(3×300 mL),飽和氯化鈉溶液(3×300 mL)洗滌,無水硫酸鈉干燥,抽濾,濾液減壓濃縮得到得灰色固體粉末(6)(30.6 g,收率95%)。ESI-HRMS(m/z): 253.05 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.97 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 4.05 (s, 3H), 2.42 (s, 3H)。

2.2.2 4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-羧酸酯(13)

將中間體6(30.0 g,75.9 mmol)和乙腈(300 mL)置于1 000 mL反應瓶中,再加入(14.9 g,83.4 mmol)的3,4-二氯-2-氟苯胺(12),室溫下攪拌4 h。TLC檢測反應完全(展開劑:二氯甲烷-甲醇,體積比20∶1),反應結束后,有固體析出。抽濾,用乙腈(60 mL)洗滌濾餅。濾餅經真空干燥(45 ℃,24 h)后得白色粉末狀關鍵中間體13,不經純化直接進行下一步反應。ESI-HRMS(m/z): 395.971 6 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.51(s, 1H), 8.87(s, 1H), 8.60(s, 1H), 7.67(dd,J=8.8, 1.7 Hz, 1H), 7.62～7.58(m, 1H), 7.49(s, 1H), 4.02(s, 3H), 2.39(s, 3H)。

2.2.3 4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-醇(14)

將中間體13(25.0 g,63.3 mmol)和甲醇(250 mL)置于1 000 mL反應瓶中,加入無水碳酸鉀(26.2 g,189.9 mmol),室溫下攪拌2 h,TLC檢測反應完全(展開劑:二氯甲烷-甲醇,體積比10∶1),減壓蒸除溶劑,將殘留物倒入水(300 mL)中,抽濾,用水洗滌濾餅,濾餅經干燥后得到黃色固體(14)(21.5 g,兩步收率96%)。ESI-HRMS(m/z): 354.053 2[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ:8.28(s,1H),7.61～7.54(m,2H),7.50(d,J=9.0 Hz,1H),7.14(s,1H),3.92(s,3H)。

2.2.4 4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(9)

將中間體14(20.0 g,56.7 mmol)和DMF(200 mL)置于1 000 mL反應瓶中,加入4-(甲苯-4-磺酰氧)哌啶-1-羧酸叔丁酯(化合物11,24.1 g,68.0 mmol)、無水碳酸鉀(23.5 g,170.0 mmol),室溫反應過夜,TLC檢測反應完全(展開劑:二氯甲烷-甲醇,體積比10∶1),將混合物減壓蒸除溶劑,得到黃色固體(9),加入二氯甲烷(30 mL)和甲醇(30 mL)的混合溶劑重結晶,得到化合物(9)純品(20.1 g,收率66%)。ESI-HRMS(m/z): 537.146 8[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ:9.63(s,1H),8.39(s,1H),7.87(s,1H),7.60(d,J=5.9 Hz,2H),7.24(s,1H),3.94(s,3H),3.69(d,J=13.3 Hz,2H),1.64(d,J=11.9 Hz,2H),1.42(s,9H),1.26～1.22(m,3H),0.84(d,J=7.3 Hz,1H)。

2.2.5 N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基-6-(哌啶-4-氧基)喹唑啉-4-胺(10)

將中間體9 (11.0 g,20.5 mmol)置于500 mL反應瓶中,滴加二氯甲烷(DCM)和三氟乙酸(體積比4∶1)的混合溶液(110 mL),室溫反應4 h,TLC檢測反應完全(展開劑:二氯甲烷-甲醇,體積比10∶1)。減壓蒸除溶劑,所得殘留物殘渣在冰浴下滴加飽和碳酸氫鈉水溶液(100 mL)調pH值至8.0～9.0,隨后用二氯甲烷進行萃取(3×150 mL),合并有機層,用無水硫酸鈉干燥,減壓蒸除溶劑得到黃色固體(10)(7.7 g,收率86%)。ESI-HRMS(m/z):437.094 6[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:9.73(s,1H),8.38(s,1H),7.86(s,1H),7.59(d,J=5.2 Hz,2H),7.23(s,1H),4.64(tt,J=8.5,3.8 Hz,1H),3.95(s,2H),3.18(s,1H),3.06(dt,J=12.5,4.6 Hz,2H),2.75～2.68(m,2H),2.05(td,J=8.0,3.8 Hz,2H),1.66～1.56(m,2H) 。

2.2.6 Poziotinib(1)

在250 mL三頸瓶中將中間體10(4.7 g,10.8 mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(50 mL),在0 ℃和氮氣保護下,并依次緩慢滴加三乙胺(3.5 g,21.6 mmol)、丙烯酰氯(1.9 g,21.3 mmol)的二氯甲烷(20 mL)溶液,室溫下攪拌進行反應12 h,TLC檢測反應完全(展開劑:二氯甲烷-甲醇,體積比10∶1)。將反應液滴進水(200 mL)中,固體析出,抽濾,濾餅用水(100 mL)洗滌,真空干燥(45 ℃,12 h)得到灰白色固體(4.9 g)。常溫下用二氯甲烷(6 mL)和甲醇(4 mL)溶解粗品,再滴加乙酸乙酯(12 mL)攪拌8 h,析出固體。抽濾,用乙酸乙酯(10 mL)洗滌,真空干燥(45 ℃,24 h)得到黃色固體(1)(4.4 g,收率84%),HPLC純度為99.46%(HPLC面積歸一化法),色譜柱:Ultimate C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A:0.1%(體積比)的三氟乙酸水溶液;流動相B:乙腈;等度洗脫(B 70%)15 min;檢測波長:254 nm;流速:0.8 mL·min-1;柱溫:40 ℃。樣品用乙腈溶解配置成濃度為100 μg·mL-1的溶液1 mL,進樣量為10 μL。ESI-HRMS(m/z): 490.097 5[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.71(s,1H),8.40(s,1H),7.90(s,1H),7.60(d,J=5.5 Hz,2H),7.25(s,1H),6.85(d,J=6.1 Hz,1H),6.14～6.10(m,1H),5.71～5.67(m,1H),4.80～4.76(m,1H),3.95(s,3H),3.89(d,J=3.7 Hz,2H),3.54～3.46(m,2H),2.02(d,J=11.7 Hz,2H),1.73～1.66(m,2H)。

3 結果與討論

3.1 起始原料的替換

本研究對工藝路線的起始物料進行重新核算,發現以5為起始原料更合適,使得反應路線由原文獻的9步縮短為6步,減少了制備步驟,節約了制備成本,也大大提高了收率(表1)。

表1 路線收率Tab. 1 The yield of each routes

3.2 合成方法優化

3.2.1 化合物6的合成方法優化

合成化合物6時,原研路線選擇三氯氧磷為氧化劑,甲苯作為溶劑,甲苯作為易制毒、易制爆試劑,在工業生成中可能無法大量使用,故優化路線后選擇中等毒性的氯化亞砜作為氯化試劑和反應的溶劑。

3.2.2 脫乙酰基方法優化

合成中間體7時,原研路線選擇以甲醇作為溶劑,氨水作為堿解試劑,但氨水在使用過程中,易揮發且有強烈的刺鼻氣味,不適合工業大規模使用。本研究采用無水碳酸鉀進行堿解,室溫反應2 h后直接抽濾并用甲醇洗滌濾餅,濾液經濃縮、干燥后得到化合物14,收率可達95.7%。采用碳酸鉀對乙酰基進行堿解,操作更為簡單,更為安全,符合工業生產的要求。兩種方法對比如表2所示。

表2 不同試劑的脫乙酰條件和產率Tab. 2 Deacetylation conditions and yields of different reagents

3.2.3 中間體10的方法優化

合成中間體10時,原研路線脫除Boc保護基時,以丙酮作為溶劑。本研究采用三氟乙酸和二氯甲烷體系進行Boc脫除,在不降低收率的同時,提高了反應的安全性。丙酮作為易制毒試劑,成本較高,據核算,噸位級丙酮價格約為二氯甲烷的1.5倍,且在研發和生產中使用頗為不便。本研究的方法可為相關化合物的脫保護提供一種參考方案。

3.2.4 中間體9和終產物純化方法優化

在純化中間體9和終產物時,本工藝路線經實驗摸索出合適的重結晶純化方法,對得到的化合物進行重結晶純化,避免了使用柱層析等純化方法,且所選擇的重結晶溶劑為工業常用品且價格低廉,更適用于工業放大生產。

4 結論

作者改進了Poziotinib的合成路線,以價格便宜的化合物5為起始原料,用氯化亞砜作為氯化原料代替三氯氧磷和甲苯,更符合工業生產要求。中間體13經過取代后以無水碳酸鉀代替氨水作為酯水解反應試劑,得到中間體14,收率得到了提高。中間體14與4-(甲苯-4-磺酰氧)哌啶-1-羧酸叔丁酯(11)酯化、脫保護基得中間體9,再與丙烯酰氯經酰化反應得到目標產物Poziotinib(1),改進后路線總收率為43.2%,該方法合成步驟短、后處理簡單,無需復雜的純化即可進行下一步反應,且使用的試劑更適合工業放大生產,可為Pozionitib及其衍生物的合成提供參考。