化濕潤睛湯通過調控COX-2、TNF-α 和 IL-6 蛋白改善去勢雄性干眼病大鼠的炎癥反應

楊金潤 ，趙歡歡 ，吳志聰 ，余戈蕊 ，馬 嵐 ，陳玉芬 ，解謾伊 ，董 玉

（1）云南中醫藥大學第一附屬醫院眼科，云南 昆明 650021;2）云南中醫藥大學基礎醫學院，云南 昆明 650500）

干眼病（dry eye disease，DED）是眼球表面淚液膜發生了質和量的異常，并伴隨眼表癥狀的一種多因素疾病[1]。發病主要原因包括淚膜不穩定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷和神經感覺異常等[2-3]。臨床眼表輕癥主要表現為眼部不適，如眼疲勞、異物感、干澀感等，而眼表重癥則會出現視力下降甚至是視物障礙等問題[4-5]。最近一項流行病學薈萃結果分析，預計全球患病率為11.9%，對于有癥狀的疾病，患病率估計為9.12%，其中女性為9.5%，男性為6.8%[6]。由于老年人口的規模不斷擴大以及信息技術設備的廣泛使用影響生活方式的變化，預計未來DED 患者的數量將迅速增加[7]。目前DED 不能完全根治，主要以替代療法、對癥治療為主。治療的藥物主要集中在抗炎癥和抗氧化方面，但化學類藥物的治療局限和副作用是臨床應用中難以克服的問題[8]。因此，從我國的傳統醫學的角度尋找效果好且副作用小中藥配方治療該病，并且深入研究其相關的分子機制將是中醫藥研究的熱點[9]。在長期臨床經驗中，云南省榮譽名中醫蘇藩教授總結出化濕潤睛湯治療干眼疾病患者，均取得良好療效[10]。然而，關于化濕潤睛湯治療干眼病的作用機制尚未做出相關研究。故本實驗制備了去勢雄性干眼病大鼠模型，觀察化濕潤睛湯對去勢雄性干眼病大鼠淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNF-α 和IL-6 的影響，以期為臨床用藥提供充足的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

1.1.1 主要試劑熒光素鈉眼科檢測試紙、淚液檢測濾紙條購自天津伊諾新康醫療器械科技有限公司；ELISA 試劑盒（大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6）均購自上海酶聯生物科技有限公司；蛋白抗體（COX-2、TNF-α、IL-6）購自江蘇親科生物研究中心有限公司。

1.1.2 主要儀器裂隙燈顯微鏡（YZ3，蘇州六六視覺有限公司）；醫用低溫保存箱（DW-86L626，青島海爾生物醫療股份有限公司）；普通冰箱（BCD-480WBPT 海爾智家股份有限公司）；臺式高速冷凍型微量離心機（CF1524R，北京開源國創科技有限公司）；電泳儀（PowerPacUniversal，美國伯樂公司）。

1.2 實驗動物及分組

60 只6 周齡雄性SD 大鼠，平均體重為（180±210）g。購買于昆明醫科大學，許可證為SCXK（滇）K2020-0004。采用熒光素鈉染色方法排除角膜有點染、潰瘍的大鼠，再將60 只角膜無熒光素鈉染色的實驗大鼠適應性喂養1 周，隨機分為4 組，分別為假手術組、陰性對照組、陽性對照組、化濕潤睛湯治療組；所有分組各15 只。每組實驗大鼠統一喂養條件，即室內溫度為（24±3）℃；室內濕度為（56±3）℃；普通飼料喂養；自由飲水和攝食。本研究動物實驗是在云南中醫藥大學動物實驗室進行，經過云南中醫藥大學實驗動物倫理委員會的審核和批準（R-062022G167）。

1.3 實驗藥物

化濕潤睛湯組成：苦杏仁10 g、薏苡仁30 g、豆蔻10 g、生白術15 g、茯苓15 g、炒柴胡10 g、女貞子15 g、杭芍15 g、枳實10 g、紅花5 g、甘草5 g。此方制備成中藥配方顆粒，按照以上劑量用150 mL 開水沖泡，待藥物冷卻至常溫后取5 mL予以灌胃。藥液濃度為0.93 g/mL。玻璃酸鈉滴眼液購自于參天制藥中國有限公司；生產批號為S1H0027。

1.4 動物模型制備方法

予以體積分數為2%的戊巴比妥鈉藥物（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉實驗大鼠，麻醉后大鼠仰臥位固定、暴露并消毒下腹部局部皮膚。切開下腹部，結扎精索靜脈及輸精管后再切除睪丸及附睪。同法切除另一側睪丸及附睪。間斷縫合腹部傷口，涂紅霉素預防感染。此外，造模大鼠予以肌內注射青霉素G 0.1 mL，每天1 次，連續注射3 d。在造模過程中出現大鼠死亡的，按照設計補齊。術后1 周進行拆線，傷口見一期愈合。假手術組實驗大鼠切開腹腔而不切除兩側睪丸及附睪；陰性對照組、陽性治療組、化濕潤睛湯治療組實驗大鼠切開腹腔并切除兩側睪丸及附睪。造模1 周后，采用FL、BUT、SIT 檢測驗證是否造模成功。造模成功的標準：與假手術組比較，出現有統計學意義的淚液分泌量減少和淚膜破裂時間縮短，并具有統計學意義，表明去勢干眼病大鼠造模成功[11-12]。實驗大鼠造模成功即可入選后續實驗。

1.5 藥物干預方式

造模后1 周待腹部傷口基本愈合后開始用藥。假手術組、陰性對照組予以等量生理鹽水灌胃，1 次/d，同時予以生理鹽水滴雙眼，1 滴/次，3 次/d；陽性對照組予以玻璃酸鈉滴眼液滴雙眼，1 次/滴，3 次/d；化濕潤睛湯治療組予以化濕潤睛湯5 mL 灌胃，1 次/d；持續用藥8 周后行FL、BUT、SIT 檢測；隨后在全身麻醉的狀態下行大鼠腹腔動脈取血，并收集大鼠雙側淚腺組織以備下一步實驗。

1.6 取材方式

實驗大鼠予以腹腔注射體積分數為2%的戊巴比妥鈉藥物（0.2 mL/100 g）麻醉，大鼠麻醉后，腹部消毒、鋪巾，由腹部切口充分暴露腹主動脈位置，進行腹主動脈血液采集；采血完成之后，實驗大鼠瀕臨死亡狀態，予以消毒并間斷縫合傷口。采集血液統一靜置20 min 后進行離心、低溫保存。各組實驗大鼠在腹腔動脈采血完成之后，切開內外眥，向外牽拉眼球，打開穹窿結膜，于球后剪斷視神經并摘除眼球，可見淚腺包裹部分后部眼球，呈不規則三角形，取出全部淚腺組織并保存。

1.7 觀察指標及檢測方式

1.7.1 FL 檢測將熒光素鈉試紙用生理鹽水蘸濕后輕觸實驗大鼠的角膜，然后在裂隙燈顯微鏡用鈷藍色彌散光觀察。損傷部位顯示為黃綠色，做拍照記錄。點狀上皮損傷將被染色，計算角膜染色“點”的數量。FL 染色評分細則見表1[13]。角膜分為5 個區，分別為上區、下區、中央區、鼻側區、顳側區，這5 個區得分相加即為染色評分。

表1 FL 評分細則Tab.1 Scoring rule

1.7.2 BUT 檢測將熒光素鈉試紙用生理鹽水蘸濕后輕觸實驗大鼠的角膜，手動使其瞬目2～3 次后在裂隙燈顯微鏡下用鈷藍光觀察并記錄淚膜破裂時間。測量3 次取平均值。

1.7.3 SIT 檢測將淚液檢測濾紙條放置大鼠下眼瞼結膜囊的內1/3 處。放置5 min 后取出濾紙，2 min 后測量試紙濕長并記錄。

1.7.4 ELISA 法血清檢測實驗大鼠血液經3 000 r/min 低溫高速離心機中離心20 min 后儲存于-80 ℃超低溫冰箱中。檢測時按照ELISA 劑盒中的說明書嚴格操作，并做結果計算和分析。

1.7.5 HE 染色取出4%多聚甲醛固定好的淚腺組織，進行脫水、石蠟包埋、切片等程序，再按照HE 染色法進行染色，最后在正置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.7.6 免疫組化將淚腺組織切片后放置于60 ℃干燥箱中進行烘烤30 min。待切片干燥后依次用二甲苯I 5 mim、二甲苯II 10 min，以及無水乙醇、95%酒精I、95%酒精II、80%酒精各5 s 進行脫蠟。再用PBS 沖洗，洗3 次，每次5 min。沖洗完成后進行抗原修復。沖洗完畢后放置于3%過氧化氫水溶液中10 min 進行阻斷，PBS 洗3 次，每次3 min。用5%BSA 牛血清蛋白進行封閉，20 min 后在切片上加入一抗并放置冰箱4 ℃孵育過夜。第2 天將過夜切片放于37 ℃溫箱中復溫1 h，再進行PBS 沖洗3 次。沖洗完成后在切片上滴加反應增強液后再用PBS 沖洗3 次，滴加二抗，PBS 沖洗3 次。再于切片上滴加DAB 顯色液，置于鏡下觀察切片顏色，待顏色強度合適后再進行PBS 沖洗。用蘇木素染色切片2 min 后，用自來水沖洗8 次以上，再用鹽酸乙醇分化10 s，自來水沖洗6 次以上，PBS 返藍20 min，最后進行脫水、封片。以上操作完成后放置切片于鏡下觀察并采集圖像。

1.7.7 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗用RIPA 蛋白裂解液提取淚腺組織細胞蛋白，并用Bio-Rad 法測定蛋白含量。取30 μg 蛋白作SDSPAGE 電泳，成功上樣之后放置配置好的電泳液里進行分離，分離成功后再將蛋白轉移至PVDF膜上。電轉完成后將PVDF 膜用TBST 溶液浸泡洗滌3 次。5% 脫脂牛奶浸泡1 h，60 r/min。將PVDF 膜用TBST 液浸洗，洗凈加入一抗，放置搖床慢搖45 min，后直接存放于4 ℃冰箱中過夜。第二日取出放到搖床上慢搖恢復室溫30 min，用TBST 液浸洗3 次，回收一抗。加入過氧化物酶標記的相應的二抗，搖床搖1 h，TBST 洗3 次，每次5 min。洗凈之后棄去TBST 液進行顯影和曝光成像，利用ImageJ 分析軟件進行分析。以βactin 作為內參，實驗重復3 次及以上。

1.8 統計學分析

本實驗采用SPSS 20.0 軟件進行數據的統計分析。計量資料用平均值±標準差（）表示，正態分布數據，對方差齊的數據的組間比較以及多重比較采用方差分析，方差不齊時采用Welch檢驗及Games-Howell 檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組實驗大鼠FL 檢測結果比較

2.1.1 角膜熒光素鈉染色（1）造模1 周后：假手術組角膜無大量陽性著染現象；陰性對照組、陽性對照組、化濕潤睛湯治療組角膜陽性著色面積增多；（2）用藥8 周后：陰性對照組陽性著色面積增加；陽性對照組和化濕潤睛湯治療組陽性著色面積相對較少，見圖1。

圖1 各組實驗大鼠造模1 周后與用藥8 周后熒光素鈉染色結果Fig.1 FL results after 1 week of modeling and 8 weeks of treatment in each group

2.1.2 FL 評分（1）造模1 周后：與假手術組比較，陰性對照組實驗大鼠FL 評分較多，差異具有統計學意義（P＜0.05）；（2）用藥8 周后：與假手術組比較，陰性對照組FL 評分增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組和化濕潤睛湯治療組FL 評分較低，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組實驗大鼠FL 評分結果比較[（），分]Tab.2 FL scoring results for each group（，Points）

表2 各組實驗大鼠FL 評分結果比較[（），分]Tab.2 FL scoring results for each group（，Points）

*P＜0.05；與假手術組比較，△P＜0.05，與陰性對照組比較，#P＜0.05。

2.2 各組實驗大鼠BUT 檢測

（1）造模1 周后：與假手術組比較，陰性對照組實驗大鼠淚膜破裂時間縮短，差異具有統計學意義（P＜0.05）；（2）用藥8 周后：與假手術組比較，陰性對照組淚膜破裂時間縮短，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組和化濕潤睛湯治療組淚膜破裂時間延長，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組實驗大鼠BUT 檢測結果比較[（），s]Tab.3 BUT test results for each group[（），s]

表3 各組實驗大鼠BUT 檢測結果比較[（），s]Tab.3 BUT test results for each group[（），s]

*P＜0.05；與假手術組比較，△P＜0.05，與陰性對照組比較，#P＜0.05。

2.3 各組實驗大鼠SIT 檢測

（1）造模1 周后：與假手術組比較，陰性對照組實驗大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）；（2）用藥8 周后：與假手術組比較，陰性對照組淚液分泌量減少（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組和化濕潤睛湯治療組淚液分泌量增多（P＜0.05），見表4。

表4 各組實驗大鼠SIT 檢測結果比較[（），mm]Tab.4 SIT test results for each group[（），mm]

表4 各組實驗大鼠SIT 檢測結果比較[（），mm]Tab.4 SIT test results for each group[（），mm]

*P＜0.05；與假手術組比較，△P＜0.05，與陰性對照組比較，#P＜0.05。

2.4 各組實驗大鼠 ELISA 檢測結果比較

與假手術組比較，陰性對照組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平增高（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平變化不明顯（P＞ 0.05）；與陰性對照組比較，化濕潤睛湯治療組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平下降（P＜0.05）；與陽性對照組相比，化濕潤睛湯治療組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平下降（P＜ 0.05），見表5。

表5 各組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平變化結果比較[（），pg/mL]Tab.5 Levels of COX-2、TNF-α、IL-6 in serum of each group [（），pg/mL]

表5 各組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平變化結果比較[（），pg/mL]Tab.5 Levels of COX-2、TNF-α、IL-6 in serum of each group [（），pg/mL]

*P＜0.05；與假手術組比較，△P＜0.05；與陰性對照組比較，#P＜0.05；與陽性對照組比較，▲P＜0.05。

2.5 各組實驗大鼠HE 染色

假手術組實驗大鼠淚腺組織腺泡大小規則，排列有序，結構清晰，胞質內見大量的酶原顆粒。與假手術組比較，陰性對照組淚腺組織腺泡大小變小，結構紊亂，形狀不規則，胞質內酶原顆粒明顯減少，并可見大量炎性細胞浸潤。與陰性對照組比較，陽性對照組和組小腺泡萎縮程度明顯改善，大小基本一致，結構較為清晰，排泄大致有序，酶原顆粒數量增多，其中陽性對照組炎性細胞浸潤面積無明顯改變，化濕潤睛湯治療組淚腺組織中炎性細胞浸潤面積明顯改善，見圖2。

圖2 各組實驗大鼠淚腺組織病理形態情況（HE 染色，×400）Fig.2 Pathological morphology of lacrimal gland tissue in each group（HE，× 400）

2.6 各組實驗大鼠免疫組化檢測

與假手術組比較，陰性對照組實驗大鼠淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達水平增高（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組實驗大鼠淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞ 0.05）；與陰性對照組比較，化濕潤睛湯治療組實驗大鼠淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNFα 和IL-6 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，化濕潤睛湯治療組實驗大鼠淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖3～圖5。

圖3 各組實驗大鼠淚腺組織COX-2 的表達情況（免疫組化，×400）Fig.3 The expression level of COX-2 in lacrimal gland tissue of experimental rats in each group（immunohistochemistry，× 400）

圖4 各組實驗大鼠淚腺組織TNF-α 的表達情況（免疫組化，×400）Fig.4 The expression level of TNF-α in lacrimal gland tissue of experimental rats in each group（immunohistochemistry，× 400）

圖5 各組實驗大鼠淚腺組織IL-6 的表達情況（免疫組化，×400）Fig.5 The expression level of IL-6 in lacrimal gland tissue of experimental rats in each group（immunohistochemistry，× 400）

2.7 各組實驗大鼠WB 檢測

與假手術組比較，陰性對照組淚腺組織中COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達水平增高（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組淚腺組織中COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞ 0.05）；與陰性對照組比較，化濕潤睛湯治療組淚腺組織中COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，淚腺組織中COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖6、表6。

圖6 各組實驗大鼠淚腺組織中COX-2、TNF-α 和IL-6的蛋白表達情況Fig.6 Protein expression of COX-2，TNF-α，and IL-6 in lacrimal gland tissue of experimental rats in each group

表6 各組實驗大鼠淚腺組織中COX-2、TNF-α、IL-6 蛋白表達情況（，n=3）Tab.6 COX2，TNF-α，and IL-6 protein expression in lacrimal gland tissues of experimental rats in each group（，n=3）

表6 各組實驗大鼠淚腺組織中COX-2、TNF-α、IL-6 蛋白表達情況（，n=3）Tab.6 COX2，TNF-α，and IL-6 protein expression in lacrimal gland tissues of experimental rats in each group（，n=3）

*P＜0.05；與假手術組比較，△P＜0.05；與陰性對照組比較，#P＜0.05；與陽性藥物治療組比較，▲P＜0.05。

3 討論

干眼病并無明確的中醫病名，《中醫藥治療干眼臨床應用指南》將干眼病列為“神水將枯，白澀癥，干澀昏花”的范疇[14]。筆者在臨床中發現干眼病患者中脾胃濕熱證比例較高，脾胃濕熱證主要是由于過食寒涼生冷、辛辣刺激、肥甘厚膩之品，導致脾胃蘊積濕熱，氣機不暢，目竅失養所致。蘇藩教授認為脾胃濕熱證白澀癥發病的主要病機為脾胃濕熱積聚，肝血肝陰不足，清氣不升，目失濡養所致。采用健脾化濕、濡養肝陰的治則，予以化濕潤睛湯治療該疾病。方中苦杏仁宣利肺氣、氣化則濕亦化；白蔻仁芳香化濕，行氣寬中；薏苡仁滲利濕邪；生白術、茯苓健脾滲濕；以上配藥以祛濕邪、助脾胃之運化。柴胡、白芍、枳實、甘草調合肝脾；柴胡辛散，疏肝解郁，調暢氣機、升發陽氣；白芍酸收，斂肝和營，使陰血歸經；二藥合用，共奏疏肝、升陽、斂陰之效。配枳實瀉脾之壅滯；配甘草能伍白芍柔肝緩急。女貞子滋補肝腎，更有明目之效；紅花入心、肝經，活血通絡。以上諸藥相合，共奏健脾化濕、濡養肝陰、潤睛明目之效。

本實驗通過切除雄性大鼠兩側睪丸及附睪制備去勢干眼病模型，基于2 個方面的考慮：（1）該造模方式操作過程簡單且成功率高；（2）與干眼病的發病機制以及本實驗選擇的檢測指標密切相關。目前，干眼病具體的發病機制尚未完全闡述清楚。有研究表明，多因素導致淚膜功能障礙會造成淚腺炎癥的發生，最終損害眼表上皮結構，促進干眼病的病程進展[15]。已有研究證實，雄激素調節淚腺和瞼板腺的功能，雄激素缺乏可能會促進淚腺炎癥、瞼板腺功能障礙，進而加重干眼病[16-17]。動物實驗研究提示，雄激素通過減少炎性因子IL-1 和TNF-α 的表達而產生抗炎作用，可有效地防止淚腺的炎癥反應和萎縮[18]。本實驗采用FL、BUT、SIT 檢測方法驗證實驗動物模型，結果顯示，模型組角膜熒光素鈉陽性染色面積增加、FL 評分上升、淚膜破裂時間縮短以及淚液分泌量減少，與正常組、假手術組比較差異有統計學意義（P＜0.05），表示造模成功。用藥8 周后，化濕潤睛湯減少了角膜熒光素鈉陽性染色面積、降低了FL評分、縮短了淚膜破裂時間以及增加了淚液分泌量，與模型組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。提示化濕潤睛湯對去勢干眼病大鼠具有顯著療效。此外，干眼疾病中一系列炎癥反應會造成淚腺組織結構損傷和破壞，并出現相應的病理形態學改變。在本實驗研究中，觀察到模型組淚腺腺泡細胞萎縮變小、形狀不規則，結構紊亂，胞質內酶原顆粒減少，并見大量炎性細胞浸潤。化濕潤睛湯改善了淚腺組織形態學變化，并顯著減輕了淚腺組織內的炎性浸潤程度。提示化濕潤睛湯對去勢干眼病大鼠淚腺中的炎性反應具有一定的改善作用。

多種炎癥介質產生的免疫炎癥反應是介導干眼病發生發展的關鍵病理因素。環氧合酶2（COX-2）是一種調節人體炎癥的同工酶，在釋放促炎介質時表達[19]。已知COX-2 常表達于眼部組織[20]。臨床研究顯示，干眼患者的COX-2 的表達水平以及其產物前列腺素E2（PGE2）增加[21]。COX-2 的過表達會產生過多的內源性PGE2 進入到淚液和眼表，在炎癥早期能夠在局部誘導并激活白細胞、巨噬細胞和肥大細胞[22-23]。TNF-α 由T 淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞產生，是炎癥反應過程中出現最早且最重要的炎癥介質[24]。并且與中性粒細胞相互作用，促進多種促炎因子的生成，如誘導炎性細胞產生白細胞介素，加速炎癥的發展。IL-6 是一種調節炎癥反應的細胞因子，可調節B 細胞和T 細胞的功能。但IL-6 并不單獨發揮作用，常與TNF-α 發生交互性協同作用。本實驗研究結果顯示，用藥8 周后，觀察化濕潤濕湯治療組血清中COX-2、TNF-α、IL-6 水平低于模型組（P＜0.05）；此外，觀察化濕潤濕湯治療組淚腺組織中COX-2、TNF-α、IL-6 蛋白水平低于模型組（P＜0.05）。表明化濕潤濕湯可降低血清炎性因子水平、抑制淚腺組織中炎性因子的表達，提示化濕潤濕湯可能通過下調炎癥因子COX-2、TNFα 和 IL-6 的表達，減輕去勢干眼病大鼠的炎癥反應。

綜上所述，化濕潤濕湯可改善去勢干眼病淚腺組織的病理形態學改變，可減輕去勢干眼病的炎癥反應，其作用機制可能與抑制淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNF-α 和IL-6 表達相關。