柴胡皂苷A 對噪音誘發(fā)耳鳴小鼠抑郁的干預(yù)作用及機(jī)制

張 艷 ，趙浩杰 ，段明志 ，段靜燕 ，楊雪艷

（1）保山市人民醫(yī)院耳鼻喉科;2）腫瘤科；云南 保山 678000;3）保山中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，云南 保山 678000）

耳鳴（Tinnitus）是指無相應(yīng)的外界生源刺激下，患者卻可以感受到耳內(nèi)或顱內(nèi)產(chǎn)生持續(xù)或間斷性聲音的主觀感覺[1]。耳鳴的發(fā)生機(jī)理可以分為主觀性耳鳴和客觀性耳鳴。其中，客觀性耳鳴較為少見，是由內(nèi)部生物源性聲音引起的，可以通過儀器檢測或被其他人聽到，這種耳鳴具有確切的生源，通常與中耳或腦部血管發(fā)育異常等相關(guān)；主觀性耳鳴的發(fā)生率較高，是指缺乏相應(yīng)生源的耳鳴，也是平常所指耳鳴，與中耳炎、噪聲暴露、聽覺通路腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等相關(guān)[2]。耳鳴的患病率較高，國外數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示成年人中約有10.1%的人患有耳鳴[3]，而在我國成年人中約有11.4%的人患有耳鳴，且患病率隨著年齡的增加而升高[4]。耳鳴可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)注意力不集中、失眠、焦慮、易怒、抑郁、恐懼等嚴(yán)重的精神癥狀，甚至可能會引起自殺。這些負(fù)面情緒會進(jìn)一步使患者對耳鳴更加敏感，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)精神和行為異常[5]。目前臨床尚無有效治療耳鳴的藥物，因此探究耳鳴的發(fā)病機(jī)制對治療耳鳴有重要意義。噪聲是世界上公認(rèn)的危害之一，其可通過損傷聽覺系統(tǒng)等多個系統(tǒng)影響人的聽覺和記憶能力等多方面的功能[6]。柴胡的主要有效成分之一是柴胡皂苷A（saikosaponin A，SSA），其具有多種藥理活性，如抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用。近年對SSA 的研究主要集中在抗癲癇、抗抑郁和抗炎等研究，而癲癇和抑郁的發(fā)病與炎癥因子密切相關(guān)[7]，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)SSA 可通過抑制核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路發(fā)揮較強(qiáng)的抗炎活性[8]，但目前關(guān)于SSA能否通過影響炎癥因子對耳鳴小鼠發(fā)揮治療作用鮮有報道，因此本研究從實踐角度出發(fā)，用噪音誘導(dǎo)耳鳴小鼠模型探究，探究SSA 對耳鳴小鼠的干預(yù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物7～8 周齡，50 只聽力正常的C57BL/6 雄性小鼠，體質(zhì)量18～20 g，動物均購自成都達(dá)碩實驗動物實驗公司，許可證號為：SCXK（川）2013-0024。小鼠均分籠飼養(yǎng)于統(tǒng)一的動物房內(nèi)，溫度21～25 ℃，相對濕度50%～60%，光照12 h/12 h 晝夜交替，自由攝食飲水。本研究經(jīng)保山市人民醫(yī)院動物倫理委員會審批通過（20220012）。

1.1.2 試劑和儀器柴胡皂苷A（SSA 化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1，質(zhì)量分?jǐn)?shù) ＞ 98%，批號：130301，美國Sigma-Aldrich 公司）；IL-1β、IL-6、TNF-α 抗體（美國Cell signaling technology 公司）；驚跳反射實驗系統(tǒng)（美國Med Associates 公司）；音響（HARMAN International 公司）；視頻行為學(xué)分析系統(tǒng)（美國HAVARD APPARAUTUS panlab 公司）；超凈工作臺（新加坡藝思高科技有限公司）。

圖1 SSA 化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 SSA chemical structure

1.2 方法

1.2.1 分組和模型制備[9]將50 只小鼠隨機(jī)分為對照組（Control 組）10 只和造模組40 只。將造模組40 只小鼠制備噪音誘發(fā)耳鳴小鼠模型，將造模組小鼠均置于標(biāo)準(zhǔn)隔音室內(nèi)，采用100 dB SPL 的寬頻帶噪聲（broadband noise，BBN）進(jìn)行噪聲單次暴露2 h；為了避免實驗動物在暴露期間相互影響入耳聲強(qiáng)以及相互撕咬，將小鼠分別放置在長4.5 cm、寬4.5 cm、高8 cm 的鐵絲籠內(nèi)，在不影響聲音傳播的同時小鼠能自由活動。將音響放在籠子前方進(jìn)行實驗。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)頭部搖晃、耳朵抖動、耳朵摩擦等耳鳴行為。Control 組小鼠置于相同的金屬籠中，并于標(biāo)準(zhǔn)隔音室內(nèi)放置2 h，但關(guān)閉揚聲器。實驗結(jié)束各組小鼠均分籠飼養(yǎng)并進(jìn)行后續(xù)檢測。

造模成功后將40 只小鼠隨機(jī)分為4 組，即噪音誘發(fā)耳鳴小鼠模型組（BBN 組）、BBN 組基礎(chǔ)上分別灌胃10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg 的柴胡皂苷A 干預(yù)，分別設(shè)為SSA-L 組、SSA-M 組和SSAH 組，每組10 只。Control 組和BBN 組小鼠均灌胃等量的生理鹽水。各組小鼠均每次灌胃1 次，連續(xù)灌胃28 d。

1.2.2 耳鳴行為學(xué)檢測各組小鼠分別于噪聲暴露2 h 后3 d、14 d、28 d 時進(jìn)行耳鳴行為學(xué)測定。在進(jìn)行前間隙抑制聽覺驚跳反應(yīng)（gap prepulse inhibition of acoustic startle response，GPIAS）實驗之前，需要先讓小鼠在透明盒子中適應(yīng)10 min。實驗過程中，將每只小鼠放置在一個透明盒子中，并將盒子放置在靈敏的壓電傳感器上。通過檢測小鼠肌肉動作幅度的波形，自動計算出相應(yīng)的波幅，以進(jìn)行實驗。GPIAS 實驗包括30 次有間隙試驗（gap 試驗）和30 次無前間隙試驗（no gap 試驗）采用隨機(jī)配對法消除有前間隙試驗和無前間隙試驗偏差。耳鳴行為學(xué)檢測以GPIAS 抑制率作為檢測指標(biāo)，即

1.2.3 焦慮抑郁樣行為評估[10]每只小鼠于給藥后1 d，分別采用曠場實驗、高架十字迷宮實驗、強(qiáng)迫游泳實驗來評估各組小鼠的焦慮抑郁情緒。實驗前1 h 將測試小鼠單籠單只放置于測試室內(nèi)以適應(yīng)環(huán)境，全部行為測定結(jié)束后將小鼠放回原始籠中。

（1）曠場實驗：制備5 個相同大小、內(nèi)壁及底部均為白色的礦場箱，長寬均為45 cm，高為30 cm。將礦場儀器放于燈的正下方，面向箱壁將小鼠放于不同的礦場箱內(nèi)中央與周圍區(qū)交界處，讓小鼠在礦場內(nèi)自由活動10 min。取出測定后的小鼠放回籠內(nèi)，將小鼠的排泄物清理干凈。礦場箱底部為25 個正方形，中間9 個正方形為中央?yún)^(qū)，采用視頻行為學(xué)系統(tǒng)采集并記錄小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)時間及在中央?yún)^(qū)距離。

（2）高架十字迷宮實驗：高架十字迷宮由2 條開放臂、2 條閉合臂和1 個聯(lián)合4 條臂的中央?yún)^(qū)平臺組成，形狀呈十字形，各面均為白色。每個臂和平臺的距離為50 cm。為確保亮度相等，高架被置于燈的正下方，避免陰影。在測試中，將小鼠背對實驗員放置在中央?yún)^(qū)，面對其中一條開放臂。然后，讓小鼠在高架內(nèi)自由活動5 min。測試結(jié)束后，將小鼠放回籠子中，并清理高架上的分泌物。在進(jìn)行下一輪測試前，使用酒精擦拭干凈高架各部分。記錄小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)及在開放臂的時間。

（3）強(qiáng)迫游泳實驗：進(jìn)行小鼠強(qiáng)迫游泳測試時，需要使用直徑為16 cm、高為30 cm 的2 個玻璃燒杯，并在每個杯子加入溫度為28 ℃的水，深度達(dá)20 cm。然后將小鼠放置在其中1 個燒杯內(nèi)，確保小鼠可以直立在水中，但尾巴不觸及杯底。觀察小鼠是否漂浮或擺動，并保持其頭部浮在水面，僅單下肢微顫狀態(tài)。借助手動計數(shù)器，在5 min 內(nèi)記錄小鼠的不動時間。測試結(jié)束后將小鼠擦拭干凈后放回籠中。

1.2.4 ABR 閾值測定各組小鼠于藥物干預(yù)結(jié)束后36 h 測定聽力。進(jìn)行小鼠ABR 閾值測試時，先在麻醉狀態(tài)下將記錄電極放置于顱頂皮下、參考電極放置在右耳乳突部皮膚下，接地電極放置在左耳同一位置。然后使用耳機(jī)依次刺激click 聲、8 kHz、16 kHz 和32 kHz 的純音，從70 dB 開始每降低10 dB，并在閾值附近改為5 dB 遞減。測定前五個波中最后一個消失的波確定閾值，并將被消失時的聲強(qiáng)數(shù)值與上一個仍有波的聲強(qiáng)數(shù)值取平均值作為閾值。在測定過程中要保持小鼠體溫并確保其舒適度。

1.2.5 RT-qPCR 檢測小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達(dá)3%戊巴比妥鈉腹腔注射30 mg/kg 麻醉小鼠，斷頭處死小鼠，取聽覺皮層組織研磨，加入1 mL TRIzol 裂解液裂解，提取裂解后細(xì)胞和組織中總RNA，提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。瞬時離心各引物（引物序列見表1），在引物中加入去離子水并制成100 μmol/L 的液體，稀釋引物終濃度為10 μmol/L。按照以下條件擴(kuò)增引物，預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 10 s；退火60 ℃ 20 s；延伸72 ℃ 10 min；共30 個循環(huán)。用2-△△CT法分析表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.6 Western blot 檢測小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β 蛋白表達(dá)麻醉并處死小鼠，取聽覺皮層組織，提取組織中總蛋白，用BCA 法檢測總蛋白濃度。將蛋白溶液的終濃度配制為2 μg/mL，將蛋白溶液置于熱水中煮沸10 min，后保存在-20 ℃冰箱中。將30 μg 的蛋白樣品用200 V電壓電泳，通過電轉(zhuǎn)的方式將SDS-PAGE 分離膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h，將一抗IL-6、TNF-α、IL-1β（1∶1 000）加入到PVDF 膜上，4 ℃孵育過夜；將PVDF 膜沖洗干凈后加入二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h。ECL 發(fā)光液加入到細(xì)胞中，曝光顯影后用Image Lab 軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)使用Graphpad priam 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，并用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示計量資料。針對不同組間的數(shù)據(jù)，采用單因素方差（oneway ANOVA）分析來進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較。同時使用LSD-t檢驗來比較組間兩兩比較的差異。根據(jù)實驗結(jié)果，若P＜0.05，則表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠耳鳴行為學(xué)比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠在噪聲暴露2 h后3 d、14 d 和28 d 時GPIAS%值降低（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSA-M 組和SSA-H組小鼠在噪聲暴露2 h 后3 d、14 d 和28 d 時GPIAS%值升高，且呈劑量依賴（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠噪聲暴露2 h 后不同時間節(jié)點中GPIAS%值比較（，n=10）Tab.2 Comparison of GPIAS% values at different time points after 2-hour noise exposure in each group of mice（，n=10）

表2 各組小鼠噪聲暴露2 h 后不同時間節(jié)點中GPIAS%值比較（，n=10）Tab.2 Comparison of GPIAS% values at different time points after 2-hour noise exposure in each group of mice（，n=10）

*P＜0.05；與Control組相比，▲P＜0.05；與BBN組相比，#P＜ 0.05；與SSA-L組相比，△P＜0.05；與SSA-M組相比，☆P ＜0.05。

2.2 各組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)時間和進(jìn)入中央?yún)^(qū)距離比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)時間和進(jìn)入中央?yún)^(qū)距離均縮短（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSA-M 組 和SSA-H 組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)時間和進(jìn)入中央?yún)^(qū)距離均增加，且呈劑量依賴（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)時間和進(jìn)入中央?yún)^(qū)距離比較Fig.2 Comparison of the time and distance of mice entering the central region in each group

2.3 各組小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)及進(jìn)入開放臂的時間比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)和時間均減少（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSAL 組、SSA-M 組和SSA-H 組小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)和時間均增加，且呈劑量依賴（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)及進(jìn)入開放臂的時間比較Fig.3 Comparison of the number of times and time of mice entering the open arm in each group

2.4 各組小鼠強(qiáng)迫游泳實驗不動時間比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠不動時間增加（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSAM 組和SSA-H 組小鼠不動時間均減少，且呈劑量依賴（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組小鼠強(qiáng)迫游泳實驗不動時間比較Fig.4 Comparison of immobility time in forced swimming experiments of mice in each group

2.5 各組小鼠ABR 閾值改變比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠在Click 和8、16、32 kHz 聲刺激下ABR 閾值均升高（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSA-M 組和SSA-H組小鼠在Click 和8、16、32 kHz 聲刺激下ABR閾值均降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組小鼠在Click 和8、16、32 kHz 聲刺激下ABR 閾值改變Fig.5 Changes in ABR threshold of mice in each group under Click and 8，16，and 32 kHz sound stimulation

2.6 各組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達(dá)比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達(dá)均升高（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSA-M 組和SSA-H 組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達(dá)均降低，且呈劑量依賴（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達(dá)比較Fig.6 IL-6 and TNF in the auditory cortex of mice in each group-α And IL-1 β MRNA expression comparison

2.7 各組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β 蛋白表達(dá)比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α、IL-1β 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSA-M 組和SSA-H組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α、IL-1β 蛋白表達(dá)均降低，且呈劑量依賴（P＜0.05），見圖7。

圖7 各組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α、IL-1β 蛋白表達(dá)比較Fig.7 IL-6 and TNF in the auditory cortex of mice in each group-α、IL-1 β Comparison of protein expression

3 討論

耳鳴是由多種因素共同作用的一種疾病，其患病率較高，目前臨床的治療方案效果不顯著且治愈率較低，嚴(yán)重影響患者的心理健康和生活質(zhì)量[11]。目前，噪聲已成為導(dǎo)致青少年和大學(xué)生出現(xiàn)耳鳴的常見因素之一。寬頻白噪聲是人們?nèi)粘Ｉ钪薪佑|最多的一種噪聲類型，因其以較均勻分布的能量播放所有頻率而備受關(guān)注。利用噪聲誘導(dǎo)耳鳴動物模型結(jié)合GPIAS 檢測方式，可更有效地模擬人類耳鳴，降低訓(xùn)練時間成本，同時不對動物造成損傷，因此該方法可相對可靠地反應(yīng)動物是否出現(xiàn)耳鳴行為[12]。本研究中采用了100 dB SPL 白噪聲環(huán)境中單次暴露2 h 后，發(fā)現(xiàn)了小鼠在3 d、14 d 和28 d 時間節(jié)點時GPIAS%值較Control組均降低，提示造模成功。100 dB SPL 寬頻噪聲誘發(fā)的耳鳴行為更顯著，可在毛細(xì)胞和聽覺中樞上產(chǎn)生明顯變化，從造模角度證明這類噪聲有利于構(gòu)建穩(wěn)定、便捷的耳鳴動物模型，同時可有效節(jié)約時間。唐薇等[13]研究證實，100 dB SPL 寬頻帶白噪聲可能更適合高效、便捷地構(gòu)建噪聲性耳鳴動物模型，且噪聲可能通過上調(diào)GAP-43 表達(dá)介導(dǎo)耳鳴的發(fā)生發(fā)展。

作為中國傳統(tǒng)中藥材之一，柴胡歷史悠久，并可根據(jù)形狀分為南柴胡和北柴胡。其具有多種功效，如和解少陽、疏肝解郁、熱血入室等。柴胡主要藥理活性成分包括柴胡皂苷A、B、C、D，其中柴胡皂苷A 具有較好的抗癲癇、抗抑郁和抗炎作用[14]。近年來發(fā)現(xiàn)[15]，盡管耳鳴的發(fā)病率較高，但只有少數(shù)患者（不到20%）會對其適應(yīng)不良而嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，導(dǎo)致焦慮和抑郁等精神情緒障礙。本研究通過曠場實驗、高架十字迷宮實驗、強(qiáng)迫游泳實驗來評估小鼠的焦慮抑郁情緒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耳鳴小鼠有明顯的抑郁行為、且聽力受到明顯損傷，柴胡皂苷A 干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，小鼠的GPIAS%值、進(jìn)入中央?yún)^(qū)時間、進(jìn)入中央?yún)^(qū)距離、進(jìn)入開放臂次數(shù)和時間均增加，小鼠不動時間及在Click 和8、16、32 kHz 聲刺激下ABR 閾值均減少，提示柴胡皂苷A 可明顯改善耳鳴小鼠的抑郁行為，保護(hù)耳鳴小鼠聽力。研究發(fā)現(xiàn)[16]，柴胡皂苷A 可以抑制利血平誘導(dǎo)的抑郁小鼠表現(xiàn)出的怠倦和上瞼下垂的現(xiàn)象。吳啟洋等[17]在強(qiáng)迫游泳實驗和懸尾實驗中發(fā)現(xiàn)，SSA 可以明顯改善表現(xiàn)絕望行為的抑郁小鼠，從而緩解其抑郁癥狀。

炎癥是一種免疫反應(yīng)，通常是身體對傷害或感染的反應(yīng)，其可導(dǎo)致身體產(chǎn)生一系列化學(xué)物質(zhì)，包括炎癥因子，如細(xì)胞因子、趨化因子和炎癥介質(zhì)。這些炎癥因子會引發(fā)免疫反應(yīng)，促使白細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位，以清除病原體或修復(fù)受損組織。近年來研究發(fā)現(xiàn)[18]，炎癥因子與耳鳴的發(fā)病機(jī)制可能存在一定的關(guān)聯(lián)。炎癥反應(yīng)可以引發(fā)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷或異常興奮，可能會引起耳鳴的發(fā)生。此外，一些研究表明，炎癥因子的產(chǎn)生和釋放可能與聽覺系統(tǒng)的功能失調(diào)相關(guān)。Tetteh 等[19]在對一項慢性耳鳴患者的研究發(fā)現(xiàn)，放松訓(xùn)練可顯著減少患者的焦慮抑郁和耳鳴，這些癥狀的減輕和血清中TNF-α、IL-6 等減少密切相關(guān)。目前，對于柴胡皂苷A 治療抑郁的機(jī)制研究主要關(guān)注于其對神經(jīng)炎癥的抑制以及對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)。在抑郁過程中，抗炎性細(xì)胞因子和前炎性細(xì)胞因子都對其產(chǎn)生影響。其中，前炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 等，在抑郁發(fā)病中起著重要的作用。研究表明[20]，SSA 可通過抑制海馬區(qū)IL-1β、IL-6、TNF-α 等表達(dá)發(fā)揮抗抑郁作用，表明SSA 抗抑郁的機(jī)制可能是通過介導(dǎo)圍絕經(jīng)期海馬的神經(jīng)炎癥介導(dǎo)的。本研究結(jié)果顯示，耳鳴小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表達(dá)均升高，提示耳鳴小鼠存在神經(jīng)炎癥，和上述研究結(jié)果一致；經(jīng)過柴胡皂苷A 干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，耳鳴小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表達(dá)均降低，提示柴胡皂苷A 可抑制耳鳴小鼠神經(jīng)炎癥，進(jìn)而改善耳鳴小鼠抑郁行為。

綜上所述，柴胡皂苷A 可改善耳鳴小鼠抑郁行為，對耳鳴發(fā)揮治療作用，其可能和抑制耳鳴小鼠聽覺皮層炎癥因子密切相關(guān)。由于時間和成本等因素，本研究未能給予陽性藥物進(jìn)行干預(yù)，僅設(shè)置了和對照組比較，使文章的結(jié)果可能存在一定的局限性，在今后的研究中會增加相關(guān)的陽性對照分組，從而為臨床治療提供更真實有效的實驗依據(jù)。