基于響應面法優化水鬼蕉中水仙環素的提取工藝

黃 云 ，趙安楠 ，劉秋月 ，高偉民 ，李 霽

（1）昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500;2）云南省生態環境監測中心，云南 昆明 650534）

水鬼蕉（Hymenocallis littoralis）又名蜘蛛蘭，為石蒜科水鬼蕉屬植物。水鬼蕉性溫味辛，以葉及鱗莖入藥具有舒筋活血，消腫止痛的功效以及良好的抗腫瘤活性。文獻報道其抗腫瘤活性主要來自于生物堿，其生物堿成分繁多復雜，現已知的生物堿有pancratistatine（水鬼蕉堿）、narciclasine（水仙環素）、7-deoxynarciclasine、7-deoxy-transdihydronarciclasine、littoraline、haemanthamine、hippeastrine、O-methyllycorenine、lycorine、homolycorine、lycorenine、lycoramine、vittatine、demethylmaritidine、pretazettine、tazettine、5，6-dihydrobicolorine、macronine 等18 種[1]。

Patrick Dumont 等[2-3]對水鬼蕉中活性生物家水仙環素進行藥理實驗研究，發現水仙環素具有明顯的抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤細胞凋亡的作用。該化合物能夠通過抑制FAK 信號通路抑制食管癌細胞的增殖和遷移[4]，調節組織蛋白酶B和細胞外信號相關激酶途徑抑制口腔癌轉移[5]，通過Akt/mTOR 信號通路誘導胃癌細胞自噬介導的凋亡[6]。此外，水仙環素還具有較好的抗炎活性[7]。

水仙環素（圖1）具有良好的藥理活性，但其含量較低，此外，其對照品價格昂貴，并且尚無較好的合成路徑，嚴重阻礙后續系統性實驗研究。為了得到大量高純度水仙環素，有必要對其提取、分離、制備等條件進行優化。提取是制備過程中的第一步，增大提取率是要解決的首要問題。

圖1 水仙環素的結構Fig.1 The structure of narcicycline

目前文獻報道的關于水鬼蕉中水仙環素的提取方法是甲醇冷浸。冷浸法簡便易行，但有提取效率較低，提取物質雜質多，提取時間過長等缺點[8-12]。

此外，在提取實驗中，通常存在提取實驗因素水平眾多，并且存在交互作用等問題，因此考察提取因素水平時，會使用正交設計以及響應面設計來輔助設計最佳提取工藝。響應面設計建立預測模型，并且對模型適應性、模型顯著性、系數顯著性和失擬項進行檢驗，從而進一步進行方差分析、模型診斷[12-16]。與常用的正交設計相比，響應面法能針對具體范圍利用爬坡試驗得出可代表各因素交互關系的條件組合，此法更具有直觀性、精確性。

本實驗在考慮實驗條件和可操作性的前提下，通過比較冷浸法、回流提取法和超聲波提取法，同時綜合考慮水仙環素提取率、提取時間等因素，并以水仙環素含量為評價指標，在單因素試驗基礎上，采用響應面法優化提取水仙環素，高效液相色譜法（HPLC）測定其含量，為水仙環素的單體分離制備提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（日本島津，型號LC-2050C）、電子天平（慈溪市天冬衡器場，型號HX1002T）、超聲清洗儀（昆明中元美生物技術公司，型號SK3200H）、旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司，型號BNS-14）、磁力加熱攪拌器（上海泰坦科技股份有限公司，X85-2S）。

水鬼蕉（采于昆明呈貢）、水仙環素對照品（成都曼思特生物科技，純度99.00%）、超純水系統（力康公司，NW 基礎系列）。

1.2 實驗方法

1.2.1 水仙環素的提取方法將水鬼蕉洗凈，取其莖部陰干，粉碎后過60 目篩，備用。3 種不同的提取方法如下：A 回流提取法：精密稱取原料粉末10.00 g，置于25 mL 圓底燒瓶中，加入甲醇后，在70 ℃的油浴中、15 ℃的冷凝條件下回流2 h，備用。B 超聲提取法：精密稱取原料粉末10.00 g，置于100 mL 錐形瓶中，加入甲醇后，室溫下超聲30 min。C 冷浸法：精密稱取原料粉末10.00 g，置于100 mL 錐形瓶中，加入甲醇后，密封保存24 h。待完成后，抽濾，濾液在45 ℃下旋蒸濃縮，轉移至25 mL 容量瓶中定容，備用。

精密稱取原料粉末9 份，均分為3 組（即A 回流組、B 超聲組、C 冷浸組），每組3 份，每份10.00 g，以液料比為3∶1 (mL/g)加入甲醇，按不同的提取方法試驗，按“1.2.2 項下（1）”色譜條件進樣并測定其峰面積，考察不同提取方法的提取率。

（1）單因素實驗考察：以回流溫度（70 ℃）、回流時間（2 h）、液料比[3∶1（mL/g）]為參考依據，確定實驗各單因素水平。回流溫度考察：精密稱取原料粉末15 份，每份10.00 g，固定回流時間（2 h）、液料比[3∶1（mL/g）]，考察回流溫度為60、70、80、90、100 ℃時的水仙環素的峰面積（n=3）。回流時間考察：精密稱取原料粉末15 份，每份10.00 g，固定回流溫度（上述實驗最優結果）、液料比[3∶1（mL/g）]，考察回流時間為1、2、3、4、5 h 的水仙環素的峰面積（n=3）。液料比考察：精密稱取原料粉末15 份，每份10.00 g，固定回流溫度（上述實驗最優結果）、回流時間（上述實驗最優結果），考察液料比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1（mL/g）的水仙環素的峰面積（n=3）。3 個因素考察實驗樣品回流結束后，均抽濾旋蒸，用甲醇溶液轉移至25 mL容量瓶中定容，備用。

（2）響應面優化實驗考察：變量包括溫度、時間、液料比，以水仙環素提取率為響應值。結合Box-Behnken 法，設計實驗因素及水平（表1）。

表1 因素水平Tab.1 The level of factors

1.2.2 水仙環素含量測定

（1）色譜條件的選擇：色譜柱使用Diamonsil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱，柱溫25.00 ℃，流速1 mL/min，進樣量為5 μL，檢測波長設定為254 nm，流動相采用純水（A）-乙腈溶液（B）進行梯度洗脫，洗脫條件見表2。

表2 高效液相色譜梯度洗脫條件Tab.2 The gradient elution condition of HPLC

（2）標準曲線的繪制：取25 mL 容量瓶，精確加入水仙環素對照品0.000 5 g，甲醇定容，備用。精密吸取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 置于10 mL 容量瓶，甲醇定容至刻度線。按“1.2.2 項下（1）”色譜條件進樣。實驗結果：在0.2～1.6 μg 范圍內，水仙環素的峰面積與濃度線性關系良好，回歸方程為：y=172.14x+8.9（R2=0.999 7），其中y 表示峰面積，x 表示濃度，單位μg/mL。

（3）精密度實驗：取“1.2.2 項下（2）”中的對照品溶液，連續重復進樣5 次。每次進樣量為5 μL，結果表明，水仙環素峰面積的RSD 為1.640%。

（4）重復性實驗：取同一水鬼蕉樣品細粉（10.00 g）5 份，分別置于25 mL 圓底燒瓶中，加入甲醇后，在70 ℃的油浴中、15 ℃的冷凝條件下回流2 h，按照“1.2.2 項下（1）”色譜條件測定峰面積。水鬼蕉樣品水仙環素提取率平均值為1.38×10-4%，RSD值為0.582%，表明該方法重復性良好。

（5）穩定性實驗：試品溶液在室溫下分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h 進樣，記錄相應的峰面積值。結果水仙環素峰面積的RSD 值為1.20%，表明供試樣品溶液在18 h 內穩定性良好。

（6）加樣回收率實驗：精密稱取水鬼蕉樣品，配制成0.6、0.8、1.0 μg/mL（n=3），并分別向其中加入水仙環素對照品0.2 mL（0.8 μg/mL），測定峰面積，計算平均加樣回收率為100.28%（分別為：100.30%、100.80%、99.75%）；RSD 值為0.52%。

2 結果

2.1 3 種不同提取方法的比較結果

由圖2 和表3 可知：峰面積的大小為回流組 ＞冷浸組 ＞ 超聲組，其中回流組峰面積為冷浸組2 倍，且時間遠小于24 h，故排除冷浸組。在此實驗中，雖然回流組時間（2 h）大于超聲組（30 min），但其峰面積接近超聲組峰面積的5 倍，因此，選擇回流提取繼續后續單因素實驗。

表3 3 種不同提取方法峰面積Tab.3 The peak area of three different extraction methods

圖2 3 種不同提取方法典型色譜圖（n=3）Fig.2 Typical chromatogram of three different extraction methods（n=3）

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 不同溫度對水仙環素提取率的影響固定液料比為3∶1（mL/g）、回流時間為2 h 的條件下，考察回流溫度為60、70、80、90、100 ℃時水仙環素提取率的變化，結果見圖3。隨著提取溫度的升高，水仙環素的提取率也在相應的增加，90 ℃時達到最大值，因此選擇90 ℃進 行后續回流時間對水仙環素提取率的影響實驗。

圖3 不同溫度對水仙環素提取率的影響（n=3）Fig.3 The effect of different temperature on the extraction rate of narcicycline（n=3）

2.2.2 不同時間對水仙環素提取率的影響在回流溫度為90 ℃、液料比為3∶1（mL/g）的條件下，考察回流時間為1、2、3、4、5 h 時水仙環素提取率的變化，結果見圖4。由圖4 可知，水仙環素的提取率隨時間的增加而呈現遞增的趨勢，在實驗結果中，5 h 時達到最大值，如果繼續延長時間，提取率依舊會增加。

圖4 不同提取時間對水仙環素提取率的影響（n=3）Fig.4 The effect of different extraction time on the extraction rate of narcicycline（n=3）

2.2.3 不同液料比對水仙環素提取率的影響在回流溫度為90 ℃、回流時間為2 h 的條件下，考察液料比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1（mL/g）時水仙環素提取率的變化，結果見圖5。由圖5 可知，隨著液料比的增加，水仙環素的提取率液也相應的增加，但是在4∶1 時略有下降，在5∶1 時達到最大，故選擇5∶1。

圖5 不同料液比對水仙環素提取率的影響（n=3）Fig.5 The effect of different ratio of solid to liquid on the extraction rate of narcicycline（n=3）

2.3 響應面結果與分析

2.3.1 回歸方程的建立與分析依據單因素實驗結果，以提取溫度（A）、提取時間（B）、提取液料比（C）為響應面自變量，根據Box-BehnkenDesign試驗設計原理，對考察因素及其水平進行設計，其中分析因子12 個、零點5 個，共17 個試驗點，零點試驗進行5 次，并利用 HPLC-PDA 檢測技術對提取結果進行分析，實驗結果見表4。

表4 響應面實驗設計及結果Tab.4 Experimental design and results of response surface method

二次多項式回歸模型得到擬合方程：Y=3.40+0.068A+0.13B+0.11C+0.040AC-0.027BC-0.37A2-0.51B2-0.56C2。利用ANOVA 分析不同實驗條件下水仙環素的含量結果，有效性。模型回歸系數顯著性檢驗結果見表5。模型的F 值為10.99，P為0.002 3，小于0.05，表明該模型具有統計學意義。失擬項是為了比較模型誤差與重復測量值誤差之間的不同，用以評估二次多響應面模型的適合性。其P值為0.756 8，表明模型顯著且適當。所有數據表明響應值與二次多項式能夠很好的吻合，所以繼續在后續實驗中使用這個模型。方差分析顯示，校正決定系數R2=0.933 9，進一步說明了模型的擬合度優。因此可用該方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。

表5 二次多項式回歸模型的方差分析結果Tab.5 Anova result of quadratic polynomial regression model

2.3.2 響應面交互作用分析采用Design Expert 8.0 對表4 數據繪制響應面圖，可真實反映出各因素的交互作用，曲面圖的陡峭程度顯示出各因素對水仙環素提取率的影響程度，響應面坡度越陡，說明該因素影響較大。

圖6 為液料比為5∶1 mL/g 條件下，提取溫度與時間的交互作用與水仙環素提取率間關系的三維曲面圖與等高圖。由圖6 可以看出，在回流溫度處于80 ℃～90 范圍內，水仙環素提取率隨著溫度的升高而增加，在回流溫度處于90 ℃～100 ℃范圍內，水仙環素提取率隨著溫度的升高而呈現下降趨勢。當回流時間在3～4 h 之間時，水仙環素提取率隨著時間的延長而不斷的上升，隨著回流時間繼續延長，水仙環素提取率略有下降。當回流時間一定時，繼續增加回流溫度，不一定會提高提取率，從而繼續升溫的意義不大。

圖6 溫度和時間對提取率交互影響的三維曲面圖Fig.6 Three-dimensional surface diagram of interaction effect of temperature and time on extraction rate

圖7 為回流時間為4 h 條件下，回流溫度與液料比的交互作用與水仙環素提取率間關系的三維曲面圖與等高圖，由圖7 可知，在回流溫度處于80 ℃～90 ℃范圍內，水仙環素提取率隨著溫度的升高而增加，在回流溫度處于90 ℃～100 ℃范圍內，水仙環素提取率隨著溫度的升高而呈現下降趨勢。在液料比處于4∶1～5∶1 mL/g 范圍內，水仙環素提取率隨著液料比的增加而提高，在液料比處于5∶1～6∶1 mL/g 范圍內，水仙環素提取率隨著液料比的增加而趨于平穩。

圖7 溫度和液料比對提取率交互影響的三維曲面圖Fig.7 Three-dimensional surface diagram of interaction effect of temperature and liquid-solid ratio on extraction rate

圖8 為回流溫度在90 ℃條件下，提取時間與液料比的交互作用與水仙環素提取率間關系的三維曲面圖和等高線，由圖8 可知，當回流時間在3～4 h 之間時，水仙環素提取率隨著時間的延長而不斷的上升，隨著回流時間繼續延長，水仙環素提取率略有下降。在液料比處于4∶1～5∶1 mL/g 范圍內，水仙環素提取率隨著液料比的增加而提高，在液料比處于5∶1～6∶1 mL/g 范圍內，水仙環素提取率隨著液料比的增加而呈現下降趨勢。當回流時間處于3～4 h 之間，液料比處于4∶1～5∶1 mL/g 之間時，響應面達到最高點。

圖8 時間和液料比對提取率交互影響的三維曲面圖Fig.8 Three-dimensional surface diagram of interaction effect of time and liquid-solid ratio on extraction rate

響應值通過下述經驗公式算得：

其中，y為響應值；k為變量/因素數；b0為截距參數；bi，bij，bii分別為線性回歸參數、相互作用參數和二次項因子。

3 討論

本實驗以昆明呈貢產水鬼蕉為實驗對象，通過比較回流提取法、超聲波提取法、冷浸法得出回流提取法的提取率最優。并且采用Design-Export8.0 軟件，對回流提取法提取進行工藝優化。響應面設計能夠通過更為直觀的圖形、精密度較高的數學模型獲得最佳工藝，與正交試驗法相比，數據處理能力更高的有點，此外還能反映各個因素之間交互作用。

本實驗得到響應面法優化回流提取法提取水仙環素的最佳工藝為液料比5.09 ∶1 mL/g、提取溫度為90.97 ℃，提取時間為4.13 h。結合實際操作條件，調整選用回流溫度91 ℃，回流時間4 h，液料比為5∶1 mL/g，在此條件下重復3 次試驗，水仙環素提取率分別為3.40×10-4%，3.38×10-4%，3.36×10-4%，平均值為3.38×10-4%，與理論預測值基本一致，說明該模型準確可靠。通過比較，擇優選取的提取工藝提取率相比較而言更高，可為進一步開發利用水鬼蕉中的水仙環素提供科學合理的理論和試驗依據。