基于UPLC-Q-TOF-MS 的馬蹄地上莖化學成分分析

魏 佩，陳 思，高紫珊，敬思群*，蕭雅泳，謝鎮蔚，劉根梅，華軍利，劉桂枝

（1.韶關學院食品學院，廣東 韶關 512005；2.韶關樂昌北鄉鎮東莞駐鎮工作隊，廣東 樂昌 512200）

馬蹄（Eleocharis dulcis（Burm.f.）Trin）屬于莎草科馬蹄屬水生植物，學名荸薺，又名地栗、烏芋、鳧茨、通天草等，因外形似馬蹄而得名[1]。馬蹄球莖營養豐富，有“地下雪梨”“江南人參”等美稱。據測定，每100 g 鮮品中，含水分68 g、碳水化合物21.8 g、蛋白質1.5 g、脂肪0.1 g、粗纖維0.5 g，還含有鈣、磷、鐵、胡蘿卜素、維生素B1、維生素B2、維生素C、尼克酸等[2-3]。關于馬蹄的研究大多集中在馬蹄球莖[4-6]和馬蹄皮[7-9]的化學成分、采后貯藏保鮮、活性成分與功能作用及功能基因研究等方面。魏榮銳等[10]從荸薺乙酸乙酯部位分離并鑒定了16 個苯丙素類化合物，結果發現其對細胞損傷具有一定的保護作用；何纖等[11]利用超聲波提取法制備馬蹄皮多酚，發現馬蹄皮多酚可抑制大鼠紅細胞溶血，對大鼠超氧陰離子自由基、羥基自由基有極強的清除作用。李紅俠等[12]采用超聲輔助提取荸薺皮中的總黃酮，發現其具有較好的抗氧化活性。上述研究多側重于馬蹄球莖和馬蹄皮，關于馬蹄地上莖研究鮮見報道。《本草綱目》中記載，馬蹄的地上莖在中藥上稱“通天草”，有清熱利尿等作用。Jing 等[13-14]研究發現與馬蹄同科的植物油莎草地上莖葉總黃酮有顯著的抑菌性、抗氧化性、干預缺血性腦中風等生物活性，于是推測馬蹄地上莖有潛在的開發價值。然而目前地上莖大多用于飼料或丟棄，造成資源的浪費，并引發環境污染問題。因此，開展地上莖高值化利用研究有實際意義。

超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜法（Ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS） 結合了超高效液相色譜和高分辨質譜的優點，是一種快速、靈敏度高、分離能力高、準確的數據采集技術，被廣泛地應用于中藥復雜化學成分的結構鑒定。王茂媛等[15]采用UPLC-Q-TOF-MS 技術對益智種子和果皮乙醇提取物的非揮發性成分進行了分析；蔡定吉等[16]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術研究紫丁香的化學成分。目前尚未見此技術用于馬蹄成分分析的報道。本文采用UPLC-Q-TOF-MS 法對馬蹄地上莖化學成分進行快速分析，基于強大精確的質譜分析平臺和ChemSpider 在線檢索數據庫，結合文獻報道信息，綜合化合物相應結構特征、精確相對分子質量和質譜裂解規律，對化學組分進行識別鑒定，以期為進一步闡釋其藥效物質、作用機制及高值化開發利用方式提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

干燥的馬蹄地上莖，由廣東省韶關市樂昌北鄉桂源馬蹄流通合作社提供。

乙腈（質譜純），美國Fisher 公司；甲酸（質譜純），德國Merck Millipore 公司。

Q Exactive Plus Orbitrap 高分辨液質聯用儀，Thermo Fisher 公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，DHG-9146，上海錦賦實驗儀器設備有限公司；U3000 超高效液相色譜及自動進樣器，美國Thermo Fisher 公司；Vortex-2 Genie 渦旋混合器，美國Scientific Industries 公司；5810R 低溫離心機，中國Eppendorf 公司；WD-9415C 超聲波清洗器，北京市六一儀器廠；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美國Waters 公司。

1.2 方法

1.2.1 化學成分分析

按照GB 5009.5—2016 第一法測定蛋白質含量[17]；按照GB/T 5009.10—2003 測定粗纖維的含量[18]；按照GB 5009.268—2016 第一法、GB 5009.268—2016 第二法，采用電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-OES）測定礦物元素的含量[19]；按照NY/T 1295—2007 測定馬蹄地上莖總黃酮含量[20]；按照GB/T 8313—2018 第四法測定茶多酚含量[21]。

1.2.2 UPLC-Q-TOF-MS 技術分析馬蹄地上莖化學成分

（1）樣品預處理

取馬蹄地上莖200 mg，冷凍研磨，在真空度150 Pa、-43 ℃下真空冷凍干燥56 h。加入10 mL 50%甲醇水溶液，超聲30min，取上清液1mL置于離心管，14000 r/min 離心5 min， 取上清液過0.22 μm 微孔濾膜后，待UHPLC-MS/MS 分析。空白樣品采用相同條件處理。

（2）液相條件

色譜柱：ACQUITYUPLCHSST3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫：35 ℃，進樣體積：10 μL，流速：0.3 mL/min，流動相：A（去離子水，含0.1%甲酸）；B（乙腈，含0.1%甲酸），梯度洗脫，0→10→25→30→40→45 min，A 分別70%→70%→60%→50%→30%→0。

（3）質譜條件

采用Q Exactive Orbitrap 高分辨質譜進行質譜數據采集，檢測模式為Full MS-ddMS2，正離子和負離子模式分別掃描，掃描范圍為m/z 100～1 200，MS1 分辨率設置為70 000，MS2 分辨率設置為17 500，離子源電壓為3.2 kV，毛細管離子傳輸管溫度為320 ℃，輔助氣加熱溫度為350 ℃，鞘氣流速為40 L/min，輔助氣流速為15 L/min，AGC Target 設置為1e6，TopN 設置為5，觸發MS2掃描的碰撞能量采用階梯式碎裂電壓NCE，設置為30、40、50。

1.3 數據處理

應用LC-MS 液質聯用儀采集數據，進行馬蹄地上莖化學成分的定性分析。采用Compound discover 3.2 進行原始Raw 質譜數據特征峰提取，特征峰元素匹配、分子式預測及同位素分布匹配的質量偏差均設置為5×10-6以內。采用mzcloud 在線數據庫和本地自建mzVault 中藥天然產物數據庫進行特征峰鑒定，陽性結果篩選標準為質量偏差小于5×10-6，符合同位素分布及mzVault best match 數據庫匹配得分大于70 分。經過手動確認和重復結果剔除后即得到化合物信息。

2 結果與分析

2.1 馬蹄地上莖化學成分分析

由表1 知，馬蹄地上莖含蛋白質11.2%（苜蓿14%[22]）、粗纖維26.0%，礦物元素錳126 mg/kg、鉀2.46×104mg/kg、鈣3.22×103mg/kg、硒0.079 6 mg/kg，可作為優質飼料。

表1 馬蹄地上莖化學成分Table 1 Chemical composition of stems of water chestnut

2.2 馬蹄地上莖UPLC-Q-TOF-MS 測定

離子在電場中加速，在磁場中偏轉。正離子源適用于堿性化合物，由于含氮化合物更容易黏附氫正離子，在正離子源中容易出分子離子峰。負離子源適合酸性化合物，由于酸性化合物更容易轟擊掉氫正離子，如酸、酚類化合物。實驗分別采用正負離子模式下同時分析可以全面反映馬蹄地上莖的化學成分，結果見圖1、2。

圖1 正離子模式下的馬蹄地上莖BPI 色譜圖Fig.1 Base peak chromatograms (BPI) with positive ion mode of stems of water chestnut

圖2 負離子模式下的馬蹄地上莖BPI 色譜圖Fig.2 Base peak chromatograms (BPI) with negative ion mode of stems of water chestnut

通過與對照品、文獻和自建數據庫信息相比對，對馬蹄地上莖總離子流圖中的各離子峰進行鑒定，分析化合物的保留時間、精確相對分子質量和碎片離子信息，結合質譜裂解規律共推測出66 個化學成分，其中包括30 個黃酮類（41.342%）、4 個生物堿類（24.089%）、15 個有機酸類（20.896%）、7 個酯類（8.185%）、2 個蒽醌類（3.081%）、4 個醛類（1.375%）、2 個醇類（0.544%）、1 個苯丙素類（0.125%）和1 個其他成分（乳糖，0.362%），見表2。

表2 馬蹄地上莖化學成分的UPLC-Q-TOF-MS 鑒定結果Table 2 Identification of chemical constituents from stems of water chestnut by UPLC-Q-TOF-MS

由表2 可知，馬蹄地上莖生物活性成分主要是黃酮類，其次是生物堿和有機酸。黃酮類化合物有棕矢車菊素（25.607%）、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷（3.488%）、芹菜素（2.720%）、木犀草素（2.568%）、葛根素（0.784%）等10 種化合物，生物堿有甜菜堿（11.683%）、水蘇堿（6.570%）、左旋肉堿（4.919%）、鹽酸胡蘆巴堿（0.917%）。棕矢車菊素[23]、芹菜素[24]、木犀草素[25]具有抗癌和抗炎作用，能夠降低炎性因子水平；橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷[26]、葛根素[27]等具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化以及增強免疫力等藥理活性；甜菜堿具有抗炎作用而預防肝臟損傷[28]；水蘇堿具有改善微循環、抗纖維化、抗炎、神經保護等生物活性[29]。綜上，開展對馬蹄地上莖活性成分的開發利用有一定的可行性，尤以黃酮類成分為主，在后期研究予以特別關注。

3 結論

馬蹄地上莖主要化學成分為蛋白質11.2%、粗纖維26.0%，還含有總黃酮（0.42）%、茶多酚（1.4%），可作為優質飼料。UPLC-Q-TOF-MS 技術分析馬蹄地上莖得到66個化學成分，其中包括30 個黃酮類、4 個生物堿類、15 個有機酸類、7 個酯類、2 個蒽醌類、4 個醛類、2 個醇類、1個苯丙素類和1 個其他成分（乳糖），馬蹄地上莖生物活性成分主要是黃酮類（41.342%）， 其次是生物堿（24.089%）、有機酸（20.896%），可作為具有抗炎和抗癌作用天然藥物資源，為進一步深入研究該植物清熱利尿作用的活性部位、尋找其藥效物質、闡明作用機制奠定了基礎，同時為馬蹄地上莖高值化利用提供了科學依據。