藍莓中花青素的提取工藝研究

李艷秋，陳丹丹，賈 娟

（1.漯河職業技術學院食品學院，河南 漯河 462002；2.河南工業大學漯河工學院，河南 漯河 462002；3.河南豫藍環保科技有限公司，河南 鄭州 450001）

藍莓（Vaccinium spp.）屬于杜鵑花科越橘類，顆粒較小，外觀類似于橢圓，果皮上有一層果霜，果肉軟、嫩，酸甜適中，老人、小孩都可以食用，在水果中屬于上品，有很高的營養價值，因而受到人們的歡迎[1]。藍莓含有豐富的花青素，是常見果蔬中所含花青素比例最大的[2]。花青素屬于類黃酮類，是一種水溶性天然色素，在植物中比較常見[3]。目前天然存在的花青素中常見的為天竺葵色素、飛燕草色素、錦葵色素、芍藥色素、牽牛花色素、矢車菊色素。花青素在自然狀態下主要以糖苷的形式存在，稱為花色苷。花青素具有美容[4]、保護視力[5-6]、預防心血管疾病[7-9]、抗癌、抗糖尿病、抗肥胖、抗菌、預防慢性疾病[10]、抗抑郁、保護神經系統[11]、降低DNA 損傷、DNA 斷裂和細胞內活性氧種類[12]、對睪丸有靶向作用[13]等功效，在食品著色、化妝品、染料、醫藥等方面應用廣泛。

花青素的提取方法主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、酶輔助提取法等。微波輔助提取法設備昂貴，在溶劑的選擇上有一定的局限性[14-15]；超聲波輔助提取法對設備要求高[16]；酶輔助提取法提取成本較高，對溫度要求比較嚴，對提取技術要求也很高[17]。溶劑提取法是提取花青素最常見的方法，操作簡便，對設備要求不高，但存在安全隱患，有一定的毒副作用，提取時間長，提取率低，且含有雜質，溶劑消耗量大等[18]。本文以藍莓為研究對象，利用對環境相對友好的檸檬酸乙醇混合溶液為提取劑，采用單因素試驗和正交試驗從藍莓中提取花青素并優化其提取工藝，為花青素的提取提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮藍莓，產地云南，放在-4 ℃冰箱里冷藏。

1.1.2 試劑

1.2 儀器與設備

飛利浦榨汁機，HR1876，飛利浦電子香港有限公司；紫外可見分光光度計，UV-2600，尤尼柯（上海）儀器有限公司；電子分析天平，FA2004 型，上海上平儀器有限公司；離心機，TGL-16G，上海安亭科學儀器廠；數顯恒溫水浴鍋，HH-8，金壇市杰瑞爾電器有限公司；電熱恒溫干燥箱，202 型，北京市永光明醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

將購買的藍莓洗凈，稱取500 g 打勻成漿，放入冰箱中避光冷藏（-20 ℃），備用。

1.3.2 標準曲線的繪制

（1）0.8%鹽酸-乙醇混合溶液的配制

移取2 mL 濃鹽酸，用無水乙醇定容至250 mL。

（2）標準溶液的配制

總之，種子具有有性繁殖特點，基于對種子形態特征的分析，研究其與植被恢復、演替之間的關系。植被演替也給予種子的生產以及散布而形成，種子形態對植被的傳播能力具有重要的影響。基于生物學、生態學角度分析種子特征對植被恢復造成的影響，闡述植被恢復演替的干擾性因素，對于促進植物學的發展具有重要意義。

準確稱取矢車菊-3-O-葡萄糖苷標準品2.0 mg，置于10 mL 的棕色容量瓶中，用0.8%鹽酸-乙醇混合溶液溶解后定容至刻度。

（3）系列標準使用溶液的配制

用移液管分別移取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL 標準溶液于10 mL 棕色容量瓶中，用0.8%鹽酸-乙醇混合溶液溶解后定容至刻度，濃度分別為4、8、16、24、32 μg/mL。

（4）標準曲線的測定

取系列標準溶液于比色皿中，以鹽酸-乙醇混合溶液為空白，在520 nm 波長下測定吸光度。以矢車菊-3-O-葡萄糖苷的濃度為橫坐標，相應的吸光度為縱坐標，繪制矢車菊-3-O-葡萄糖苷標準曲線，得到矢車菊-3-O-葡萄糖苷標準曲線的回歸方程。標準曲線的回歸方程為y=0.050 5x+0.034 2（R2=0.998 2）。

1.3.3 花青素的提取及提取量的計算

稱取2 g（精確至0.000 1 g）的藍莓果漿于錐形瓶中，按照設定的溫度、提取劑的體積比、提取時間和料液比進行提取。提取結束后，用離心機進行離心取濾液，即為藍莓花青素提取液。取適量上清液于比色皿中，以乙醇-檸檬酸混合溶液作為空白，在520 nm 波長下測定其吸光度。花青素提取量按照公式（1）計算。

式中，c 為根據標準曲線得到的吸光度下對應的花青素濃度，μg/mL；V 為樣品和提取劑的總體積，mL；m 為所取藍莓果漿的質量，g。

1.4 單因素試驗設計

單因素試驗的基礎條件設為乙醇和檸檬酸的體積比6∶4，提取溫度40 ℃，料液比為1∶20（g/mL），提取時間為90 min。提取溫度設置為30、40、50、60、70 ℃，乙醇和檸檬酸體積比設置為3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3，提取時間設置為60、90、120、150、180 min，料液比設置為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），以花青素的提取量為評價指標，進行單因素試驗。

1.5 正交試驗設計

根據單因素試驗，選取對藍莓花青素含量影響顯著的主要因素，即提取溫度、乙醇和檸檬酸的體積比、提取時間、料液比，按照四因素三水平進行正交試驗設計，以藍莓中花青素的提取量為指標，優化藍莓花青素的提取工藝參數。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

2 結果分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 提取溫度對藍莓花青素提取量的影響

由圖1 可知，當其他條件不變時，隨著提取溫度的升高，藍莓花青素的提取量逐漸增加。當提取溫度升高到40 ℃時，藍莓花青素的提取量達到最大。而當提取溫度繼續升高時，藍莓花青素的提取量開始降低。造成這一現象的原因可能是花青素對溫度敏感，當溫度升高時花青素不穩定，結構被破壞，導致花青素分解，最終使花青素的提取量降低。因此最佳提取溫度為40 ℃。

圖1 提取溫度對花青素提取量的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of anthocyanin

2.1.2 乙醇和檸檬酸體積比對花青素提取量的影響

由圖2 可知，當其他條件不變時，隨著乙醇占比的升高，藍莓花青素的提取量逐漸增加。當乙醇和檸檬酸的體積比為4∶6 時，藍莓花青素的提取量達到最大。當乙醇占比繼續升高時，藍莓花青素的提取量開始降低。造成這一現象的原因可能是隨著乙醇濃度的升高，溶劑的極性增大，當花青素與溶劑極性相近時，其花青素的提取量達到最大值，然后隨著乙醇的濃度增加，其極性與花青素極性發生偏移，導致花青素的提取量降低，因此，最佳乙醇和檸檬酸的體積比為4∶6。

圖2 乙醇和檸檬酸體積比對花青素提取量的影響Fig.2 Effect of volume ratio of ethanol and citric acid on the yield of anthocyanin

2.1.3 提取時間對藍莓花青素提取量的影響

由圖3 可知，當其他條件不變時，隨著提取時間的延長，藍莓花青素的提取量逐漸增加。當提取時間延長到150 min，此時藍莓花青素的提取量達到最大。當提取時間繼續延長時，藍莓花青素的提取量開始降低。造成這一現象的原因可能是花青素被分解，最終導致花青素提取量降低。因此，最佳提取時間為150 min。

圖3 提取時間對花青素提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of anthocyanin

2.1.4 料液比對藍莓花青素提取量的影響

由圖4 可知，當料液比增加到1∶20（g/mL），此時藍莓花青素的提取量達到最大。當料液比繼續增加時，藍莓花青素的提取量開始降低。可能是因為，隨著提取劑的體積增大，與藍莓接觸面積增大，更易于花青素的提取，但是，當料液達到飽和狀態后，提取劑的增加會在一定程度上增大其他雜質的溶出，從而對花青素的提取效果造成影響，最終導致花青素提取量降低。因此，最佳料液比為1∶20（g/mL）。

圖4 料液比對花青素提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of anthocyanin

2.2 正交試驗結果分析

由表2 可知，影響藍莓花青素提取量的主次順序為A（提取溫度）＞C（提取時間）＞B（乙醇和檸檬酸體積比）＞D（料液比）。最優組合為A1B1C3D2，經驗證試驗該組合花青素的提取量為63.128 μg/g，均高于其他試驗組。方差分析結果見表3。由表可以看出，提取溫度（A）、乙醇和檸檬酸體積比（B）、提取時間（C）、料液比（D）這四個因素都影響藍莓花青素提取量且影響都極顯著。

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

3 結論

采用溶劑提取法，以乙醇檸檬酸混合溶液為提取劑，提取藍莓中的花青素。試驗得出最佳提取工藝參數為提取溫度30 ℃，乙醇和檸檬酸的體積比3∶7，提取時間180 min，料液比1∶20（g/mL）。此時花青素的提取量為63.128 μg/g，溶劑提取法操作簡便，雖然提取時間較長，溶劑消耗量較大，但是所選用的乙醇和檸檬酸溶液不會產生有害物質，與其它有機溶劑相比對環境友好，綠色環保。藍莓花青素作為一種安全無毒的天然色素，在食品和化妝品方面應用前景廣泛。相信隨著提取方法的不斷發展，藍莓花青素在食品、化妝品等方面的應用會更加廣泛。