陜西省野生擬黑蟲草的多基因分子生物學鑒定

孟桂花,李孟樓,王春燕

(西北農林科技大學 林學院,陜西楊凌 712100)

蟲草是蟲生真菌寄生于昆蟲蟲體后形成的菌蟲復合體,包括寄生真菌和寄主昆蟲兩部分。長期以來,人們習慣將蟲生真菌、蟲生真菌與其寄主形成的復合體均稱為蟲草,而未將二者區分開,造成了名稱使用上的混亂,易引起非專業人員的混淆。為此,Zhang等[1]提出了新的術語規則:在僅指形成蟲草的蟲生真菌時使用蟲草菌、冬蟲夏草菌等名稱,而涉及到蟲生真菌與寄主形成的復合體時使用蟲草、冬蟲夏草等名稱,由此避免名稱混淆。蟲草菌是廣義蟲草屬(Cordycepss. l.)所有真菌的統稱,作為昆蟲病原真菌,可被開發成生防菌劑,在害蟲生物防治領域發揮著重要作用[2]。蟲草菌隸屬于子囊菌門(Ascomycota),是子囊菌中多樣性較高的類群之一,全世界已報道的蟲草菌有近千種[3],中國已報道的蟲草菌約120種[4]。蟲草菌不僅種類繁多,其寄主種類也比較復雜,不同蟲草菌侵染的昆蟲種類及范圍不同,因此僅依靠傳統的形態學很難對蟲草種類進行準確的分類鑒定。近年來,分子生物學技術在蟲草菌物種鑒定及其與相關屬真菌之間親緣關系的認定中發揮了重要作用[2],極大提升了蟲草物種分類鑒定的效率和準確性。

在分子生物學鑒定過程中,由于絕大多數單基因系統進化樹在某些關鍵節點上的支持率較低、聚類可信度不高,因而僅依靠單基因進行物種的分類鑒定存在一定的局限性[4]。多基因涵蓋的信息比單基因多,通過聯合多個DNA片段構建的多基因系統進化樹能更可靠地反映物種之間真正的系統發育關系[5-6],也能明顯提高進化樹的分辨率和可信度[7]。如今,多基因聯合分析也被廣泛地用于蟲草菌分類地位的鑒定中[8-9]。Sung等[10]利用核糖體大亞基LSU和小亞基SSU、RNA聚合酶Ⅱ大亞基RPB1和小亞基RPB1及EF-1α等多個基因位點對蟲草類真菌進行了系統分類,將廣義的蟲草屬重新分成了4個屬:狹義蟲草屬(Cordycepss. s.)、鹿蟲草屬(Elaphocordyceps)、異蟲草屬(Metacordyceps)和線蟲草屬(Ophiocordyceps),該分類系統被學術界廣泛認可和接受。

張興民等[11]根據蟲草子座及蟲體形態,將陜西省旬邑縣石門山林區采集到的野生蟲草初步鑒定為山西省報道過的香棒蟲草(O.barnesii),但該林區蟲草的產量比山西的香棒蟲草大,且發現的寄主昆蟲僅小闊脛絨金龜(Maladeraovatula)1種,而已報道的香棒蟲草的寄主種類比較復雜,因此該蟲草是否為香棒蟲草需進一步驗證。本研究在形態學觀察的基礎上,通過多基因序列分析和系統進化樹的構建,以Wang等[12]建立的多基因系統進化樹為佐證,明確石門山林區蟲草的種類及其蟲草菌的分類地位,以期豐富陜西省的蟲草真菌資源,為陜西省蟲草資源的保護和可持續利用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 標本采集

野生蟲草標本采集自陜西省旬邑縣石門山林區。刮去采集的蟲草表面土壤后用報紙包裹放入滅菌的塑封袋中,置于4 ℃冰箱內保存備用。

1.2 形態觀察

測量蟲草子實體及蟲體的長度和直徑,用體視顯微鏡觀察蟲草子實體的著生位置、子實體頂部和蟲體的形態,拍照并記錄相關數據。

1.3 分子生物學鑒定

1.3.1 DNA提取

在超凈工作臺內,使用無菌手術剪將蟲草子實體和蟲體分別剪成長5 mm的小段置于培養皿中,依次用升汞水溶液浸泡30 s,75%酒精浸泡3 min,無菌水清洗4～5次。用無菌濾紙吸干樣品表面的水后將其放入無菌研缽中,加入液氮研磨成粉末。最后,用CTAB法[13]提取DNA作為后續基因擴增的模板。

1.3.2 目的基因擴增及測序

使用3對引物(ITS1和ITS4[14]、983F和2218R[15]、CRPB1和RPB1Cr[16],由上海生物工程技術公司合成)對蟲草菌DY6F的3個DNA序列位點(ITS、EF-1α和RPB1)分別進行擴增,擴增體系參照仇飛[17]的方法。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于紫外透射下觀察PCR條帶,檢測合格后送至陜西楊凌天潤奧科生物公司進行雙端測序。

1.3.3 序列比對和系統進化樹的構建

將測序所得的基因序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對,并從GenBank中分別下載同源性較高的ITS、EF-1α和RPB1基因序列,用ClustalW進行基因序列的比對,序列兩端截齊后使用Mega7.0構建單基因Neighbor-Joining(NJ)系統進化樹,進化樹各分支上的數值為經1 000次Bootstrap后的置信度。利用PhyloSuite v1.2.2(http://phylosuite.jushengwu.com/)軟件將EF-1α和RPB1的基因序列串聯成數據集,通過ModelFinder計算這2個基因序列的最佳模型,并用Mr-Bayes的貝葉斯推理法(Bayesian Intreence,BI)構建多基因系統進化樹,通過節點上的后驗概率值(Bayesian posterior probability,BP)評估構建的進化樹,最后用Chiplot網站(https://www.chiplot.online/tvbot.html)進行系統進化樹的美化[18]。

2 結果與分析

2.1 形態觀察

蟲草子實體從寄主昆蟲幼蟲頭部的下側方長出,單生,無分支,棍棒狀(圖1,A),頂部呈圓形或鈍頭狀(圖1,B),長度為3～6.2 cm,直徑為0.1～0.2 cm;新鮮時為黃褐色,曬干后呈棕褐色,品相較差。寄主為金龜子幼蟲(又稱蠐螬),蟲體粗而肥,黃色,呈直線型或C型彎曲,長度為1.2～1.9 cm,直徑0.2～0.6 cm(圖1,C)。

A.蟲草子實體形態;B.蟲草子實體頂部;C.寄主。圖1 蟲草標本的形態特征A. Morphological characteristics of fruiting body;B. Top of fruiting body; C. Host.Fig.1 Morphological characteristics of cordyceps

2.2 序列比對及系統進化分析

2.2.1 基因測序結果與序列比對

研究獲得蟲草菌DY6F的ITS、EF-1α和RPB1基因片段的長度分別為576,921,732 bp,將所得序列提交至GenBank,獲取登錄號分別為OQ711778、OQ828437、OQ828436。NCBI在線Blast比對的結果顯示,這3個基因的序列與擬黑蟲草菌(O.nigrella)相應基因序列的相似度最高(99%～100%),而與線蟲草屬(Ophiocordyceps)其他種相應基因序列的相似度只在80%～90%之間。由此可見,蟲草菌DY6F與擬黑蟲草菌的親緣關系最近。

2.2.2 單基因系統進化分析

基于所獲得的蟲草菌DY6F的3個基因片段的序列,以及下載的相似度較高的其他物種的基因序列,分別構建了ITS(圖2)、EF-1α(圖3)和RPB1(圖4)單基因NJ系統進化樹。這3個進化樹的拓撲結構基本一致,蟲草菌DY6F與擬黑蟲草菌聚集于同一個分支,支持率達到100%,表明蟲草菌DY6F與擬黑蟲草菌的遺傳距離最近。但基于ITS和RPB1基因序列構建的單基因NJ系統進化樹中,不同種的很多上級分支節點的支持率都低于60%,聚類可信度相對較低。

圖2 基于ITS序列構建的NJ系統進化樹Fig.2 NJ phylogenetic tree based on ITS sequences

圖3 基于EF-1α序列構建的NJ系統進化樹Fig.3 NJ phylogenetic tree based on EF-1α sequences

圖4 基于RPB1序列構建的NJ系統進化樹Fig.4 NJ phylogenetic tree based on RPB1 sequences

2.2.3 多基因聯合系統進化分析

通過ModelFinder計算出的EF-1α和RPB1基因數據分區的最佳模型為GTR+G+I,它們的串聯序列數據集由1 641個堿基組成,其中GC含量為56.7%,AT含量為43.3%。所構建的多基因系統進化樹各分支的支持率較高,除3個分支節點外,支持率均超過95%;不同種上級分支節點的支持率也比單基因系統進化樹中同一節點的支持率高,線蟲草屬內同種不同菌株均能聚集于同一分支,且支持率均為100%(圖5)。這表明,所構建的多基因系統進化樹的聚類結果較為可信。

圖5 基于EF-1α和RPB1序列聯合矩陣構建的BI系統進化樹Fig.5 BI phylogenetic tree inferred from combined EF-1α and RPB1 sequences

多基因系統進化樹大致可分為3個不同的系統進化支,分別為Hirsutella進化支、O.sobolifera進化支和O.ravenelii進化支;在O.ravenelii進化支的亞分支ravenelii-scarabaeidae中,O.highlandensis、O.konnoana和O.barnesii形成1個姐妹群,O.ravenelii、O.superficialis和擬黑蟲草菌形成1個姐妹群,而蟲草菌DY6F與擬黑蟲草菌聚于同一分支,支持率為100%(圖5)。綜上所述,蟲草菌DY6F被鑒定為擬黑蟲草菌,石門山林區發現的野生蟲草為擬黑蟲草,這是陜西省境內發現的又一種新的蟲草資源。

3 討 論

多基因聯合分析能突破單基因分析的局限,可以更準確地反映菌株間的親緣關系及分類地位。本研究基于蟲草菌DY6F的ITS、EF-1α和RPB1基因序列分別構建了單基因及多基因聯合系統進化樹,最終將陜西省旬邑縣石門山林區的蟲草菌DY6F鑒定為擬黑蟲草菌,野生蟲草鑒定為擬黑蟲草。擬黑蟲草是擬黑蟲草菌寄生于金龜子幼蟲后形成的菌蟲復合體,擬黑蟲草菌是廣義蟲草屬的一種,隸屬子囊菌門(Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、線蟲草科(Ophiocordycipitaceae)、線蟲草屬(Ophiocordyceps)[10]。國內外關于擬黑蟲草的研究相對較少,日本曾報道過擬黑蟲草的生長環境和宏觀形態特征[19],國內有學者對山西境內采集到的擬黑蟲草的遺傳多樣性及其區系真菌多樣性進行了研究[20-21]。本研究首次在陜西省發現了擬黑蟲草,增加了擬黑蟲草在中國的分布地區,為擬黑蟲草這一珍稀蟲草資源的利用提供了基礎。

陜西省境內發現的植物新類群較多[22-24],而關于蟲草的報道相對較少,目前已發現的蟲草種類有變形蟲草(O.variabilis)、布氏蟲草(C.brongniartii)[25]及秦巴蛹蟲草(C.militaris)[26]等,主要分布于秦嶺地區。本研究鑒定所得的擬黑蟲草是陜西省新發現的一種蟲草資源。張興民等[11]調查發現,旬邑縣藥商從2016年起就開始大量收購擬黑蟲草(曾被鑒定為香棒蟲草),每1 kg價格在600元以上,表明擬黑蟲草具有很高的藥用價值和市場前景。但目前關于擬黑蟲草生物學及化學藥理成分的研究很少,無法明確其質量、藥用功能及作用,阻礙了擬黑蟲草的開發利用。野生冬蟲夏草資源極度缺乏,國內外學者長期致力于冬蟲夏草的人工培養及其替代品的研究。培育近緣種作為冬蟲夏草替代品具有最大的優勢[27-28],擬黑蟲草與冬蟲夏草同科同屬,親緣關系較近,具有冬蟲夏草替代品的潛能,本研究未分離培養出擬黑蟲草無性型。因此,后續需加強擬黑蟲草的生物學特性及人工培育技術研究,深入考察擬黑蟲草的藥效,揭示其藥用價值,明確其被開發成冬蟲夏草替代品進行產業化生產的可行性和市場前景,并建立科學合理的保護和可持續利用機制。