超表達(dá)AVP1基因提高甜菜的耐低磷和耐鹽抗旱性

孫亞卿,王曉嬌,2,劉 雪,李寧寧,李國(guó)龍,張少英*

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,呼和浩特 010019; 2 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,呼和浩特 010031)

甜菜是中國(guó)重要的糖料作物,也是內(nèi)蒙古地區(qū)具有地域優(yōu)勢(shì)的經(jīng)濟(jì)作物。得益于生產(chǎn)種植的規(guī)模化和機(jī)械化,近年來(lái)發(fā)展勢(shì)頭良好,其生產(chǎn)主要分布在北緯40°以北各省區(qū),而該區(qū)域鹽堿、干旱土地集中,各種非生物脅迫是制約甜菜產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的主要因素之一,因此提高甜菜的抗逆性、保證甜菜產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定提升是保障甜菜生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)[1]。在傳統(tǒng)育種的基礎(chǔ)上,利用生物技術(shù)對(duì)其加以遺傳改良,以培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的新品種,對(duì)提高北方地區(qū)甜菜產(chǎn)量以及改良和利用大面積鹽堿地和荒漠化土地有重要意義[2-3]。多項(xiàng)研究證明,H+-PPase(H+-焦磷酸酶)基因的過(guò)表達(dá)可為液泡膜的次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)提供能量,在多種非生物脅迫適應(yīng)性中起著重要的作用,包括提高植物細(xì)胞對(duì)鹽堿和干旱的耐受性。

通過(guò)過(guò)表達(dá)該基因,不僅可促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株的根系生長(zhǎng),還可通過(guò)分泌有機(jī)酸,提高植物根系對(duì)磷的吸收效率[4-5]。可見(jiàn),H+-PPase基因作為提高作物抗性的候選基因是一個(gè)非常具有潛力的有效基因。本研究在已有研究基礎(chǔ)上,將擬南芥H+-PPase基因AVP1對(duì)甜菜進(jìn)行轉(zhuǎn)化,對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因甜菜植株進(jìn)行不同非生物脅迫處理(鹽脅迫、低磷和干旱),分析各處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因甜菜的磷吸收能力和抗逆性能,為培育高產(chǎn)、高抗性的甜菜新品種提供參考。

1 材料和方法

1.1 轉(zhuǎn)基因甜菜的獲得

克隆于擬南芥的AVP1基因和經(jīng)改造的攜帶AVP1基因的質(zhì)粒pCAMBIA2301(圖1)由本課題組先期完成,參見(jiàn)王曉嬌[6]方法,利用農(nóng)桿菌菌株LBA4404,對(duì)甜菜品系DF1031進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。將甜菜種殼打磨后采用10% NaClO和0.1% HgCl2各處理10 min的滅菌劑組合,MS培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗。甜菜子葉節(jié)置于MS+1.0 mg/L 6-BA的分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2～3 d,用OD600為0.4～0.5的菌液侵染6～8 min,共培養(yǎng)48 h后,轉(zhuǎn)入含0.1 g/L卡那霉素和0.3 g/L羧芐青霉素的分化培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA)上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。外植體分化出不定芽后,移到生根培養(yǎng)基(1/2 MS+2.0 mg/L NAA)上生根成苗。對(duì)得到的抗性苗隨機(jī)取樣不同部位,且經(jīng)PCR和RT-PCR檢測(cè)全部為陽(yáng)性的植株,選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株用于進(jìn)一步處理研究。

圖1 質(zhì)粒pCAMBIA2301示意圖Fig.1 Schematic map of the plasmid pCAMBIA1301

1.2 轉(zhuǎn)AVP1基因甜菜的分子檢測(cè)

1.2.1 轉(zhuǎn)基因甜菜的PCR檢測(cè)

根據(jù)所用植物表達(dá)載體序列合成引物(表1),擴(kuò)增長(zhǎng)度為600 bp的片段,分別以質(zhì)粒和野生型植株作為正負(fù)對(duì)照,用于抗性苗的基因整合鑒定。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因甜菜的qRT-PCR檢測(cè)

采用TRIzol方法提取經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性甜菜植株組織RNA,純化后的RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,步驟見(jiàn)王曉嬌方法[6]。用甜菜Actin基因當(dāng)內(nèi)參基因(表1),進(jìn)行熒光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR),分別計(jì)算不同培養(yǎng)條件(低磷、干旱、鹽脅迫)下葉片和塊根中AVP1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 材料準(zhǔn)備

對(duì)不同甜菜組培苗材料煉苗3～4 d后,將幼苗移入經(jīng)高壓滅菌過(guò)的珍珠巖/細(xì)砂/蛭石(1∶1∶1)基質(zhì)中,遮蔭3～4 d后觀察幼苗生長(zhǎng)情況,然后逐漸去除遮蔭網(wǎng),自然光照射。每2 d澆入1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液,期間溫度和濕度適宜。選取苗高、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的植株作為試驗(yàn)材料。

1.4 不同磷濃度處理

1.5 干旱脅迫處理

挑選前期培養(yǎng)的長(zhǎng)勢(shì)基本一致的轉(zhuǎn)基因和野生型植株幼苗,采用25% PEG 6000進(jìn)行干旱脅迫,不脅迫為對(duì)照,3個(gè)重復(fù),在干旱脅迫處理期間,每2 d取1次樣品測(cè)定相關(guān)指標(biāo),每個(gè)指標(biāo)6次重復(fù)。

1.6 鹽脅迫處理

挑選上述培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因和野生型植株幼苗,用l/8霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液澆灌(其中含50 mmol/L NaCl),NaCl濃度每隔1 d增加50 mmol/L,最后達(dá)到終濃度200 mmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)7 d后,取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo),每個(gè)指標(biāo)6次重復(fù)。

1.7 指標(biāo)測(cè)定

土壤總磷量采用分光光度法定量測(cè)定[7]。植株總磷量采用銻抗比色法[8]。游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮法。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)-分光光度法。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 9.0軟件進(jìn)行方差分析,利用Excel 2003進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)基因甜菜AVP1的表達(dá)差異

對(duì)經(jīng)PCR檢測(cè)鑒定為陽(yáng)性(圖2)的植株材料,采用qRT-PCR分析其在不同培養(yǎng)條件下甜菜葉片和塊根中AVP1基因表達(dá)量的差異。

M. DL3000;1. ddH2O;2. 質(zhì)粒(CK+);3. 野生型(CK-);4-10. 轉(zhuǎn)基因甜菜。圖2 T1代轉(zhuǎn)AVP1基因甜菜 PCR檢測(cè)M. DL3000; 1. ddH2O; 2. Plasmid(CK+);3. Wild-type(CK-); 4-10. Transgenic sugar beet.Fig.2 The PCR electrophoretogram of T1 generation AVP1 gene transgenic sugar beet

結(jié)果顯示,無(wú)論在不同磷處理(圖3)、高鹽和干旱脅迫(圖4)條件下,野生型甜菜葉片和塊根中AVP1基因均未表達(dá),而轉(zhuǎn)基因甜菜的葉片和塊根中AVP1均有不同程度的表達(dá),其中葉片中的表達(dá)量較強(qiáng)。與對(duì)照比較,低磷處理下,AVP1基因在葉片和塊根中的表達(dá)量均顯著增加,而在高磷處理下,AVP1基因的表達(dá)量卻沒(méi)有增加,在轉(zhuǎn)基因甜菜葉片中AVP1基因具有表達(dá)優(yōu)勢(shì)。在脅迫條件后,AVP1基因在轉(zhuǎn)基因甜菜葉片和塊根中的表達(dá)量均顯著增強(qiáng)(圖4)。

WT.野生型;AVP1.轉(zhuǎn)基因植株;不同小寫(xiě)字母代表處理間差異顯著(P<0.05)。下同。圖3 不同磷濃度對(duì)轉(zhuǎn)基因甜菜AVP1基因表達(dá)的影響WT. Wild type; AVP1. Transgenic plants; Different normal letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level (P<0.05). The same below.Fig.3 The effect of different P concentrations on the gene expression of wild and transgenic types

圖4 干旱(A)和高鹽(B)脅迫下甜菜不同器官AVP1基因表達(dá)Fig.4 AVP1 gene expression level under drought stress (A) or salt stress (B)

2.2 轉(zhuǎn)AVP1基因提高甜菜磷素吸收能力的影響

如圖5,A顯示了在不同磷供給處理下的土壤磷含量,結(jié)果顯示培養(yǎng)轉(zhuǎn)AVP1基因甜菜的土壤磷含量均低于種植WT甜菜的土壤,且差異顯著(P<0.05)。在相同的磷含量供應(yīng)和相同的處理方法下,轉(zhuǎn)基因甜菜含磷量均高于野生型甜菜,其中在CK條件下,前者比后者高出65%,可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因甜菜比野生型具有更高的磷吸收能力。

圖5 不同磷濃度對(duì)土壤和轉(zhuǎn)基因甜菜植株含磷量的影響Fig.5 The phosphorus content of soil and plants under different P concentrations

植株葉片內(nèi)磷濃度取決于土壤磷供應(yīng)水平,低磷條件(P1)下,雖轉(zhuǎn)基因甜菜和野生型甜菜的磷含量與CK條件相比均顯著降低,但轉(zhuǎn)AVP1植株仍顯著高于WT植株。轉(zhuǎn)基因甜菜的含磷量隨著磷供給的增加而增加趨勢(shì)明顯,而野生型植株在高磷條件(P3)下磷含量與CK條件無(wú)明顯差異,可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因甜菜與野生型植株相比具有充分利用過(guò)量磷的吸收能力。

2.3 轉(zhuǎn)AVP1基因甜菜抗旱性

野生型植株在正常生長(zhǎng)條件與轉(zhuǎn)基因植株在生長(zhǎng)形態(tài)上基本一致,沒(méi)有明顯差別(圖6,A)。但隨著干旱脅迫的持續(xù),野生型植株的生長(zhǎng)在處理第5天時(shí)首先出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象,生長(zhǎng)受到抑制,而同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株仍然正常生長(zhǎng),直到第7天才發(fā)生萎薦(圖6,B),而此時(shí)野生型植株表現(xiàn)受害程度更重;干旱處理第8天對(duì)所有植株做復(fù)水處理,2 d后,轉(zhuǎn)基因植株解除萎蔫并基本恢復(fù)正常生長(zhǎng),而野生型植株則發(fā)生永久萎薦,最后死亡(圖6,C)。可見(jiàn),AVP1基因的超表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因甜菜的抗旱性。

A.干旱脅迫前; B.干旱脅迫7 d; C.恢復(fù)灌水2 d。圖6 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株形態(tài)變化的影響A. Before drought stress; B. 7 days after drought stress;C. 2 days after resuming irrigation.Fig.6 The effect of drought stress on the morphological changes of transgenic type and wild

2.4 轉(zhuǎn)AVP1基因甜菜耐鹽性

選取植株生長(zhǎng)形態(tài)基本一致的轉(zhuǎn)基因和野生型植株(圖7,A)用200 mmol/L NaCl處理,1周后二者的葉片均表現(xiàn)部分變黃,生長(zhǎng)速度明顯緩慢,但野生型植株表現(xiàn)相對(duì)較嚴(yán)重的失綠現(xiàn)象。鹽脅迫處理期間,轉(zhuǎn)AVP1基因材料的長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)相對(duì)強(qiáng)于WT植株,總體受抑程度輕于野生型植株(圖7,B)。植株生物量測(cè)定結(jié)果顯示,在200 mmol/L NaCl處理14 d后,無(wú)論是地上部還是地下部,轉(zhuǎn)基因植株的生物量均顯著高于野生型植株,如轉(zhuǎn)基因植株的地上部鮮重是野生型植株的1.4倍(圖8)。可見(jiàn),AVP1轉(zhuǎn)基因植株具有比野生型植株更強(qiáng)的耐鹽性。

A.鹽脅迫處理前; B.鹽脅迫處理28 d后。圖7 鹽脅迫對(duì)野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)的影響A. Before salt stress; B. 28 days after salt stress.Fig.7 The morphological changes of transgenic type and wild type under salt stress

*表示材料間在0.05水平差異顯著。圖8 200 mmol/L NaCl處理植株生物量* represents significant difference between materials at 0.05 level.Fig.8 Biomass of plants treated with 200 mmol/L NaCl

2.5 轉(zhuǎn)AVP1基因植株中細(xì)胞膜穩(wěn)定性和滲透能力

植物器官在逆境傷害下往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用,丙二醛(MDA)是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一,其含量一定程度上可以反映遭受逆境傷害的程度[9]。

本研究中,WT植株與轉(zhuǎn)AVP1基因植株葉片中MDA含量在脅迫處理前沒(méi)有差異(圖9),但隨著NaCl濃度的增加或干旱脅迫的加劇,二者植株葉片MDA含量均呈增加趨勢(shì),但轉(zhuǎn)基因甜菜表現(xiàn)較為緩慢的增加趨勢(shì),在鹽處理14 d或干旱脅迫5 d后,二者的MDA含量開(kāi)始表現(xiàn)明顯差異,鹽處理繼續(xù)到21,28 d時(shí),WT植株的MDA含量比轉(zhuǎn)AVP1植株分別高出24.5%和26.7%;而在干旱處理5 d、7 d后,則分別高出15.6%和22.1%,由以上結(jié)果可見(jiàn)轉(zhuǎn)AVP1基因植株具有較高細(xì)胞膜穩(wěn)定性,因而比野生型植株表現(xiàn)較高抗鹽和抗旱性。

圖9 鹽脅迫(A)和干旱條件(B)下甜菜植株葉片丙二醛含量Fig.9 MDA content in leaves of sugar beet plants under salt (A) and drought (B) stress

由圖10可知,在逆境條件下,植物體內(nèi)具有較強(qiáng)水合能力的游離脯氨酸含量會(huì)顯著增加,其通過(guò)穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過(guò)程來(lái)提高植物的抗逆性。本試驗(yàn)中,轉(zhuǎn)AVP1基因甜菜植株和WT植株在鹽脅迫和干旱處理?xiàng)l件下,游離脯氨酸含量均高于處理前,但增加幅度表現(xiàn)為轉(zhuǎn)AVP1基因甜菜植株大于WT植株。

圖10 干旱(A)、鹽脅迫(B)條件下甜菜植株葉片脯氨酸含量Fig.10 Proline content in leaves of sugarbeet plants under drought (A) and salt (B) stress

鹽脅迫28 d和干旱脅迫7 d后,前者游離脯氨酸含量比后者分別高出27.1%和30.3%,均達(dá)到顯著差異(P<0.05)。表明轉(zhuǎn)基因甜菜比野生型植株具有較強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力,從而可緩解高鹽或干旱條件對(duì)植株造成的滲透脅迫,一定程度上緩解其造成的傷害。

3 討 論

由于外源基因遺傳具有不穩(wěn)定性,在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)表達(dá)水平相對(duì)較低,甚至靶基因丟失的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[10]。此外,研究發(fā)現(xiàn),在相同的條件下,用同樣的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化同一種外源基因,所獲得的轉(zhuǎn)基因植株間不僅外源基因表達(dá)水平差異很大,而且由于轉(zhuǎn)基因的間接作用還可能使轉(zhuǎn)基因植物出現(xiàn)額外的表型變異[11],這可能是由于DNA插入位點(diǎn)不同而造成的,從而在一定程度上限制了轉(zhuǎn)基因植物的商品化進(jìn)程[9]。本研究中采用qRT-PCR方法檢測(cè)AVP1基因在甜菜中的表達(dá)特性,結(jié)果表明目的基因在甜菜繼代培養(yǎng)植株中穩(wěn)定存在,在轉(zhuǎn)基因甜菜中正常表達(dá),但在根和葉中的表達(dá)強(qiáng)度不同。在溫室盆栽培養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)AVP1基因甜菜與野生型植株生長(zhǎng)表現(xiàn)無(wú)差異,說(shuō)明該外源靶基因的插入并未對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響。

甜菜對(duì)磷需求量大,但甜菜的主要產(chǎn)區(qū)的北方地區(qū)土壤普遍磷供應(yīng)不足,因有效磷濃度低、磷肥利用率低等條件對(duì)甜菜生產(chǎn)造成一定的限制。土壤中磷素容易被固定,因此植物根系發(fā)育程度對(duì)磷的吸收起重要作用[12]。研究表明H+-焦磷酸酶編碼基因的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)多種植物根系的生長(zhǎng)和發(fā)育[4-5]。本研究比較了轉(zhuǎn)AVP1基因甜菜和野生型甜菜的低磷耐受性,研究結(jié)果表明利用生物技術(shù)手段在甜菜中過(guò)表達(dá)AVP1基因提高甜菜對(duì)磷的吸收,從而提高低磷條件下甜菜的產(chǎn)質(zhì)量是可選擇的有效途徑。

干旱、高鹽等是限制植物生長(zhǎng)的主要非生物脅迫因素,利用生物技術(shù)手段將與耐鹽抗旱特性相關(guān)的外源基因引入植物中,進(jìn)而選育耐鹽抗旱新品種一直是植物抗逆研究的研究熱點(diǎn)[13]。不同非生物逆境條件可對(duì)植物細(xì)胞膜造成氧化傷害及引起滲透脅迫,進(jìn)而影響相關(guān)生理代謝過(guò)程[14]。本研究中通過(guò)分析轉(zhuǎn)AVP1基因甜菜在干旱脅迫和鹽脅迫下的生理生化指標(biāo)表明,在相關(guān)逆境脅迫下MDA含量均有所增加,但與野生型植株相比,轉(zhuǎn)基因材料具有較低MDA含量和較高游離脯氨酸含量。可見(jiàn)外源基因AVP1的表達(dá)一定程度上保護(hù)了細(xì)胞的膜系統(tǒng),同時(shí)轉(zhuǎn)基因甜菜可通過(guò)自身積累游離脯氨酸參與滲透調(diào)節(jié),緩解相關(guān)逆境條件造成的滲透脅迫,增強(qiáng)轉(zhuǎn)化植株對(duì)相關(guān)逆境脅迫的耐受性,從而可以更好地適應(yīng)干旱或鹽脅迫環(huán)境。

本研究以AVP1基因轉(zhuǎn)化甜菜,結(jié)果顯示AVP1基因可在甜菜地上、地下部表達(dá),且逆境脅迫條件下表達(dá)量增強(qiáng),轉(zhuǎn)AVP1基因甜菜具有比野生型甜菜更高的磷素吸收利用效率;干旱、鹽脅迫處理?xiàng)l件下,AVP1基因在轉(zhuǎn)基因甜菜中顯著上升,與野生型植株相比,轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)MDA含量較低而脯氨酸含量顯著增加,AVP1基因可減輕逆境對(duì)甜菜細(xì)胞膜損傷,提高甜菜細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力,由此可見(jiàn)AVP1基因過(guò)量表達(dá)一定程度上提高了轉(zhuǎn)基因甜菜的磷素吸收能力和耐鹽性、抗旱性,這對(duì)培育甜菜新品系創(chuàng)制了新的育種材料。隨著對(duì)H+-PPase功能的逐漸了解,以及對(duì)植物抗逆分子機(jī)制的研究和生物技術(shù)不斷完善,有望為培育高效、耐鹽、抗旱同時(shí)具有高效磷吸收能力的甜菜新品種開(kāi)辟新的途徑。