陸地棉GhPS2基因的克隆和表達(dá)分析

孟超敏,卿桂霞,耿翡翡,李雪林,張富厚

(河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南省旱地作物種質(zhì)資源利用工程研究中心,河南洛陽 471000)

磷素是核酸的重要組成成分之一,在植物體內(nèi)的新陳代謝中起著關(guān)鍵性的作用,低磷脅迫不利于作物生長(zhǎng)發(fā)育,缺磷棉花植株葉面積小,葉綠素含量低,生長(zhǎng)發(fā)育受阻,影響產(chǎn)量和品質(zhì)的提升[1]。向土壤中施加磷肥,磷會(huì)被快速吸附至土壤顆粒表面或者和其中的鐵、鋁、鈣等物質(zhì)反應(yīng)形成難以溶解的磷酸鹽,最終導(dǎo)致磷的有效性降低[2-3],也會(huì)造成農(nóng)田環(huán)境污染以及土壤中磷素的累積等問題。諸多研究[4-6]表明,同一作物的不同品種基因型之間在磷吸收效率和磷利用效率方面存在差異。在土壤磷有限的情況下,磷高效型作物品種通過根系吸收、磷素的同化、轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用獲取足夠的有效磷來維持植株的正常生長(zhǎng),從而形成更多的產(chǎn)量[7]。因此,為應(yīng)對(duì)缺磷帶來的生產(chǎn)危機(jī),研究作物對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)機(jī)制以及提高作物的磷利用效率顯得尤為重要。

鹵代酸脫鹵酶(HAD)超家族(HAD-like hydrolase superfamily)是以細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的鹵代酸脫鹵酶命名的,包括脫鹵酶、磷酸化酶、糖磷酸變位酶、磷酸酯酶和ATP酶等[8],該酶能水解多種有機(jī)磷酸鹽基質(zhì),這些蛋白質(zhì)在共價(jià)催化中使用保守的羧酸鹽催化磷或碳中心的親核取代反應(yīng)。在擬南芥中,磷饑餓顯著誘導(dǎo)AtPECP1和AtPS2的表達(dá)[9],在一些與磷酸鹽饑餓相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中PECP1和PS2被列為強(qiáng)誘導(dǎo)型。這些酶在饑餓條件下可以從磷酸膽堿和磷酸乙醇胺中回收磷[10-12],在擬南芥中,磷饑餓也誘導(dǎo)了HAD磷酸酶的分泌,這些磷酸酶可能參與了細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外磷的利用[13]。HAD超家族中絕大多數(shù)已知的催化活性都針對(duì)磷酰基轉(zhuǎn)移[14],而該酶蛋白催化焦磷酸鹽的高度特異性裂解,它被命名為擬南芥焦磷酸特異性磷酸酶1,代表了第1個(gè)具有這種底物特異性的HAD超家族酶[15-16]。這些研究說明HAD基因在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)磷缺乏脅迫方面起重要作用,但對(duì)于棉花HAD基因在生長(zhǎng)發(fā)育和耐受低磷脅迫方面的研究幾乎處于空白。

本試驗(yàn)以前期鑒定的磷高效陸地棉品種‘新陸早19’為材料來源[17],克隆得到GhPS2基因,并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及組織和低磷脅迫表達(dá)模式分析,為深入研究棉花GhPS2的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ),以期為棉花磷高效基因工程育種提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理方法

選取自交留種中籽粒飽滿的‘新陸早19’棉花種子用70%酒精殺菌30 min,沖洗干凈后泡種 24 h 至棉花露白,分別播種于室內(nèi)培養(yǎng)箱沙土中和河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田。沙土中的棉花在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至四葉期左右用以植株總RNA的提取。在試驗(yàn)田棉花花鈴期取根、莖、葉、花等4個(gè)組織迅速放入液氮中備用。

選取三葉一心期整齊度均勻一致的‘新陸早19’幼苗,利用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[18]培養(yǎng)1周后,進(jìn)行低磷(LP:0.01 mmol/L)脅迫處理,以適磷處理(SP:1.0 mmol/L)為對(duì)照,分別處理0,4,12,24,72 h后,取3株生長(zhǎng)一致的棉花植株,混合其根部組織作為試驗(yàn)樣品。 取樣后迅速將樣品置于液氮中冷凍,并保存于-80 ℃ 超低溫冰箱中備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

利用基因表達(dá)譜篩選得到‘新陸早19’在低磷和適磷2種不同處理下差異表達(dá)序列DT464576為探針進(jìn)行序列延伸和克隆。根據(jù)拼接的GhPS2的基因序列,使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)了克隆基因的全長(zhǎng)引物和qRT-PCR引物,內(nèi)參選用棉花GhActin基因,所有引物均由生工生物上海有限公司合成(表1)。

表1 PCR引物

1.3 陸地棉基因組DNA、總RNA提取和cDNA合成

采用CTAB法提取陸地棉基因組DNA,DNA經(jīng)Nanodrop 2000和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后保存-20 ℃?zhèn)溆谩０凑誖NAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(Tian-Gen,北京)提取棉株總RNA,然后利用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。若總RNA質(zhì)量符合要求,則根據(jù)HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit cDNA第一鏈合成試劑盒將所提取的符合要求的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,-20 ℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 陸地棉GhPS2基因克隆與測(cè)序

分別以陸地棉‘新陸早19’的DNA和的cDNA為擴(kuò)增模板,擴(kuò)增陸地棉GhPS2基因的CDS區(qū)。再利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。將目的條帶的PCR產(chǎn)物與TOPO-T載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化、菌液PCR檢測(cè),然后目標(biāo)條帶的菌液送至生工生物上海有限公司測(cè)序,并保留一些菌液。

1.5 生物信息學(xué)分析

采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的blastn和blastp分析GhPS2基因的核苷酸序列及編碼氨基酸序列的同源性,使用DNAMAN對(duì)GhPS2與同源蛋白序列多重比對(duì),使用ProtParam分析GhPS2蛋白的基本理化性質(zhì),利用SOPMA對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。基于SWISS-MODEL和CD-Search分別對(duì)GhPS2蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模和功能結(jié)構(gòu)域的分析,使用SingalP3.0和TMHMM 2.0分別對(duì)GhPS2蛋白的信號(hào)肽和跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,其磷化位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位分別利用NetPhos3.1 Server和Plant-mPLoc軟件進(jìn)行分析,利用MEGA 5.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 GhPS2表達(dá)的qRT-PCR

提取陸地棉‘新陸早19’植株不同部位(根部、莖部、葉部和花部)的RNA;提取低磷和適磷處理(0,4,12,24,72 h)的棉株根部RNA,以不同樣本的RNA模板反轉(zhuǎn)錄獲得第1條cDNA,作為qRT-PCR模板。內(nèi)參基因?yàn)镚hActin,所用引物見表1。

反應(yīng)體系按照SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit試劑盒說明配制,使用的熒光定量PCR儀型號(hào)為CFX96,采用2-ΔΔCT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量,利用Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhPS2基因克隆

利用DNASTAR將以低磷脅迫差異表達(dá)序列DT464576為探針檢索的相似序列進(jìn)行拼接,得到了片段大小為1 206 bp序列。分別以陸地棉新陸早19植株的DNA和cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1),得到的目的片段大小分別為1 717 bp(圖1,泳道1)與1 152 bp(圖1,泳道2)。該基因的開放閱讀框?yàn)?13 bp,共編碼270個(gè)氨基酸。該編碼區(qū)具有保守的DXDXT基序,因此該基因GhPS2是HAD家族成員。

2.2 GhPS2基因結(jié)構(gòu)分析

將分別以DNA和cDNA為模板測(cè)序獲得的序列導(dǎo)入分析工具GSDS(gene structure display server2.0)繪制基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖(圖2),該基因編碼序列包含3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子,含有上下游區(qū)域5′與3′非編碼序列。

M. Marker 2000;1. DNA的PCR擴(kuò)增片段;2. cDNA的PCR擴(kuò)增片段。 圖1 GhPS2基因編碼序列的PCR擴(kuò)增M. Marker 2000; 1. PCR amplified fragment of DNA;2. PCR amplified fragment of cDNA.Fig.1 PCR amplification of GhPS2 CDS

圖2 GhPS2基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 GhPS2 Gene structure analysis

2.3 GhPS2蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

陸地棉GhPS2蛋白分子式是C1346H2106N354O399S18,相對(duì)分子質(zhì)量為30.21 kD,理論等電點(diǎn)約為4.92,是一種穩(wěn)定的親水蛋白質(zhì)(不穩(wěn)定系數(shù)為33.92,總親水性平均系數(shù)為-0.041)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明,其二級(jí)結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲(39.63%)、ɑ-螺旋(38.89%)、延伸鏈(14.44%)和β-折疊(7.04%)組成。GhPS2蛋白三維結(jié)構(gòu)同源建模顯示(圖3),其含有類鹵代酸脫鹵酶。蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成,與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。SignalP分析表明,其不存在信號(hào)肽序列;TMHMM-2.0分析所編碼蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域,也不屬于跨膜蛋白。NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,GhPS2蛋白含有15個(gè)能被磷酸化的位點(diǎn)(超過閾值線),包括Ser位點(diǎn)8個(gè)、Thr位點(diǎn)6個(gè)和Tyr位點(diǎn)1個(gè)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),該蛋白定位于細(xì)胞膜,與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果相同,推測(cè)該基因可能直接在細(xì)胞膜發(fā)揮作用。

圖3 GhPS2蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Tertiary structure of GhPS2 protein

2.4 GhPS2蛋白同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用NCBI當(dāng)中的CD-search工具預(yù)測(cè)基因的保守結(jié)構(gòu)域,GhPS2蛋白含有1個(gè)特異匹配為Put_Phosphatase,共有3段保守位點(diǎn)的氨基酸,這些位點(diǎn)可能是催化位點(diǎn)或者結(jié)合位點(diǎn),匹配所屬的超家族是HAD基因家族。該基因具有HAD家族特有的DXDXT基序特征,如圖4所示。

紅色方框表示DXDXT基序。圖4 GhPS2與其他物種HAD家族同源蛋白的多序列比對(duì)分析結(jié)果The red box indicates the DXDXT motif.Fig.4 Multi-alignment of GhPS2 amino acid sequence with other HAD family in different plants

根據(jù)DNAMAN比對(duì),該基因編碼270 aa,包含了該基因完全的開放閱讀框。GhPS2蛋白序列與其他棉種PS2蛋白序列相似性達(dá)到93%,與榴蓮PS2蛋白序列的相似性達(dá)到83.15%。通過MEGA5對(duì)GhPS2和不同棉種以及其他植物同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5),陸地棉蛋白序列與雷蒙德氏棉、澳洲棉和亞洲棉在一個(gè)小支上,與不同物種中的榴蓮、毛果楊、麻風(fēng)樹、巴西橡膠樹、木薯的親緣關(guān)系最近,與其余6個(gè)物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),不在一個(gè)大支上。

圖5 GhPS2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 GhPS2 Phylogenetic tree analysis

2.5 GhPS2基因在不同組織及低磷脅迫處理下表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)GhPS2基因在根、莖、葉和花4個(gè)器官中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)GhPS2基因在不同組織中均有表達(dá),表達(dá)水平由高到低依次為根、莖、葉和花,表明GhPS2在陸地棉不同組織之間表達(dá)水平具有差異性(圖6)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6 GhPS2基因在不同組織的相對(duì)表達(dá)分析Different letters indicate significant differences (P<0.05).Fig.6 The relative expression of GhPS2 gene in tissues

對(duì)陸地棉幼苗進(jìn)行低磷脅迫,以處理不同時(shí)間的陸地棉根部組織為材料進(jìn)行qRT-PCR分析GhPS2基因表達(dá)情況,由圖7可以看出,4～72 h低磷處理下的表達(dá)量均比適磷處理下的表達(dá)量高。而低磷脅迫表達(dá)的趨勢(shì):低磷處理4 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高峰,低磷處理4～24 h這個(gè)時(shí)間段表達(dá)量逐漸下降,72 h時(shí)其表達(dá)量又明顯上升,是適磷處理的16.66倍。上述結(jié)果提示,GhPS2基因可能在棉花低磷脅迫調(diào)控中起一定的作用。

**表示與適磷處理相比差異顯著(P<0.05)。圖7 GhPS2基因在根部低磷脅迫不同時(shí)間的表達(dá)模式** indicates significant difference between suitable and low phosphorus stress at 0.05 level.Fig.7 The relative expression analysis of GhPS2 gene low phosphorus treatment at different time points in roots

3 討 論

為了應(yīng)對(duì)磷脅迫,植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的系統(tǒng)來調(diào)節(jié)對(duì)脅迫信號(hào)的適應(yīng)。適應(yīng)過程的許多方面,包括發(fā)育、生理和生化變化,都受到脅迫反應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[19-20]。本研究所得的基因序列與擬南芥中HAD家族中的無機(jī)焦磷酸酶基因PS2同源性較高[15-16],含有HAD超家族共有的結(jié)構(gòu)特征DXDXT基序,屬于HAD超家族成員。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明GhPS2蛋白主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成,基于同源建模對(duì)GhPS2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知其含有類鹵代酸脫鹵酶[8]。據(jù)報(bào)道HAD超家族成員它參與各種細(xì)胞過程,由此推測(cè)GhPS2基因具有同樣的功能。

缺磷引起植物局部或系統(tǒng)性防御反應(yīng)取決于外部磷供給水平和植物體內(nèi)磷含量分布及形態(tài),根系的形態(tài)結(jié)構(gòu)與建成過程依賴介質(zhì)中磷濃度的局部信號(hào)調(diào)控,而不是依賴植株整體磷水平的系統(tǒng)信號(hào)調(diào)控[21],但是磷的吸收、恢復(fù)、脂質(zhì)代謝、金屬轉(zhuǎn)運(yùn)及參與不同功能的基因成員都依賴于復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)[22]。鹵代酸脫鹵酶(HAD)超家族成員,受磷缺乏的調(diào)節(jié)[23]。在擬南芥中,有2種低磷反應(yīng)的HAD家族成員,AtPS2和AtPECP1分別編碼功能性焦磷酸酶和磷酸乙醇胺磷酸酶[9]。LePS2是番茄中第1個(gè)低磷誘導(dǎo)HAD超家族基因,過度表達(dá)LePS2的蛋白導(dǎo)致磷酸酶活性增加、花青素積累和番茄開花延遲[24]。LePS2的質(zhì)膜定位同系物PvPS2:1在過度表達(dá)轉(zhuǎn)基因的擬南芥中增加了磷的獲得和根系生長(zhǎng)[25]。在低磷環(huán)境脅迫下,植物會(huì)在分子機(jī)制、生理生化和形態(tài)結(jié)構(gòu)等多環(huán)節(jié)的調(diào)整來增加自身的適應(yīng)性,而根系作為植物吸收礦質(zhì)元素的主要器官對(duì)植物適應(yīng)磷饑餓具有重要作用[26-27]。本研究得到的GhPS2基因qRT-PCR定量結(jié)果表明該基因在根中的表達(dá)量最高,其次在莖和花中,在葉中表達(dá)最低。在低磷脅迫4 h時(shí)棉花根部組織的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高值,低磷處理4～72 h的表達(dá)量均大于適磷處理4～72 h,低磷脅迫72 h時(shí)是適磷處理的16.66倍,依次推測(cè)GhPS2基因在根系發(fā)揮作用,并且會(huì)持續(xù)性地對(duì)低磷脅迫作出應(yīng)答,在棉花磷信號(hào)調(diào)控機(jī)制中可能具有重要的的生物學(xué)功能。

截至目前,棉花中關(guān)于HAD基因的鑒定、等位變異和表征等信息并不多,因此為進(jìn)一步探討該基因在棉花中的生物學(xué)功能,后續(xù)可通過酵母雜交、VIGS等技術(shù)驗(yàn)證和分析GhPS2基因如何在低磷脅迫中發(fā)揮作用,并揭示該基因在棉花應(yīng)對(duì)低磷脅迫逆境時(shí)的作用機(jī)理。