原位成像檢測活性酶的分子熒光探針研究進展

張 龍，黃眾熙，沈 倩，鞠霖杰，吳 瓊，余昌敏*

（1.南京工業大學 柔性電子（未來技術）學院，江蘇 南京 211816；2.南京醫科大學 附屬腫瘤醫院，江蘇 南京 210009）

1 引言

活性酶不僅是各項生命活動的重要組成，同時也與疾病的發生有關[1-3]。例如，實驗研究表明急性胰腺炎（Acute pancreatitis,AP）的腺泡細胞損傷與組織蛋白酶B 依賴的胰蛋白酶激活密切相關[4]；抑制天冬氨酸蛋白酶β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1（Beta-Amyloid precursor protein lyase 1,BACE1）是降低阿爾茨海默病（Alzheimer's disease,AD）的一種有前景方法[5]；基質金屬蛋白酶（MMPs）使其他可溶性或膜表達的介質分子失活或激活，使它們能夠控制發育過程、組織重塑、炎癥反應和增殖信號通路，MMPs 的失調早已在急性腎損傷和慢性腎病中得到認可[6]。現代醫學已經有多種技術用于檢測活性酶，例如核磁成像、單光子發射計算機斷層成像（Single photon emission computed tomography,SPECT）以及正電子發射計算機斷層成像（Positron emission computed tomography,PECT）[7]，這些成像技術有著特定的靈敏度、空間分辨率以及穿透深度[8]。然而，目前現有的診斷方法不能直觀地反映因疾病導致活性酶的表達異常，以此區分疾病的進展期，這容易錯過最佳治療階段[3]。因此，有著較好特異性以及一定組織穿透力的熒光探針進入臨床醫學診斷中。生物活性酶熒光探針可以通過檢測酶的水平以及生物成像，判斷疾病類型以及進展期，還可以對治療方案的有效性進行反饋，促進相關抑制劑以及藥物和新型醫療方案的開發。

現今在熒光生物成像領域，研究者已經開發了多種類型熒光探針，包括肽探針、納米粒子探針以及分子熒光探針。基于蛋白酶的特異性底物例如抗體、結蛋白等開發了肽探針，肽探針對蛋白酶具有特異性表達并且蛋白酶對肽鏈作用改變結構進而引發熒光信號。這類探針具有較好的生物相容性以及靈敏度，但是分子式的尺寸大小會對腫瘤結合有所影響，肽鏈分子結構尺寸較大，可能會增加體內的循環時間，增加體內背景信號強度[9]。納米科學與生物技術的聯合也讓熒光探針領域誕生了納米熒光探針的研究，納米材料具有更高的光穩定性，納米結構可以作為載體與其他方法結合使用，以實現更強大的成像和治療功能[10-11]。然而，臨床實驗中大多數納米粒子被網狀內皮系統吸收，導致腫瘤組織內分布不均，并可能對肝、脾和肺等關鍵器官產生毒性作用[12]，為此有針對性地開發出膠囊式納米粒子探針，不過仍需要對該類探針的安全性進行長期評估。

分子熒光探針作為活細胞成像的強大工具，由于其非侵襲性以及靈敏度高、檢測限低、響應時間快和生物相容性好等特性[13-17，近年來，許多研究小組已經成功地開發了一系列用于細胞內離子、代謝物、蛋白質（包括酶）、細胞器和不同類型的細胞/組織的檢測小分子成像探針[18-21]，這些方案也逐步應用于現代醫學診斷中。19 世紀末，亞甲基藍熒光染料讓科研人員確立了進行體內染色病原體可視化診斷的想法；隨后，20 世紀小分子近紅外染料吲哚青綠（Indocyanine green,ICG）被美國食品和藥物管理局批準用于常規臨床使用，可以為肝臟腫瘤手術進行術中導航[22]。在此基礎上許多分子靶向熒光探針已被開發出來，如利用葉酸受體-α 靶向卵巢癌這一腫瘤特異性，設計的熒光探針成功在人體內實現了術中導航[23]。這些熒光團在光源的照射下吸收光子達到激發態，能量在回到基態時，由于分子振動以及弛豫現象而損失，從而發射出波長能量相較于吸收光低的熒光，產生斯托克斯位移，這也是分子熒光探針的理論基礎[24]。然而，這類小分子探針存在缺乏特異性、主動靶向性、在生物體內易擴散以及組織穿透力差等問題[25-27]。分子熒光探針在檢測蛋白質活性以及生物成像領域已經有了漫長的發展歷史，科研人員一直被小分子的毒性低、組織滲透能力好、可代謝能力強等優點所吸引。近年來，近紅外Ⅰ區以及近紅外Ⅱ區的熒光探針增強了探針的組織穿透能力，因此更多的高靈敏度、高選擇性、特異性表達的分子探針被開發出來[28-31]。

2 分子熒光探針響應機制及其檢測活性酶面臨的問題

分子熒光探針因為其尺寸小和結構明確，帶來了許多優勢。如圖1 所示，根據分子熒光變化，探針熒光的響應機制可以分為熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）[32]、分子內電荷轉移（Intramolecular charge transfer,ICT）[33-34]、光誘導電子轉移（Photoinduced electron transfer,PET）[35]、激發態分子內質子轉移（Excited state intramolecular proton transfer,ESIPT）[36]、聚集誘導發射（Aggregation-induced emission,AIE）[37]、多模態熒光方法（Multimode fluorescence method）等[38-39]。參考以上機制，分子熒光探針結構上的設計大部分由熒光團、連接劑、識別基團三個部分組成[40]。然而，尺寸小也帶來了一些問題。小分子熒光團在生物體內有著易擴散以及易被快速代謝等問題，導致熒光團分子的擴散，特別是水溶性熒光團，無法提供高時空分辨率的原位實時成像（圖2）。因此，分子熒光探針的原位成像功能特別是酶的原位檢測，目前在該領域備受關注。隨著科研人員的不斷探索，分子熒光探針檢測生物活性酶并原位成像得到了巨大發展，但仍然存在一些問題。分子熒光探針生物成像存在因為激發光或發射光波長較短造成的光損傷問題，而且一些常用熒光團無法較好展示精細的生物組織結構或者會受到生物組織散射光的影響。分子熒光探針的檢測限也是需要考慮的，較低的生物標志物檢測限可以更好地表達不同濃度生物標志物，有助于成像后的區分；同時，探針的靈敏度、特異性識別也需要注意。最后，盡管部分探針已經進入臨床，但是仍然無法滿足臨床需求，臨床轉譯工作仍需努力。

圖1 熒光響應機制示意圖。（a）FRET 機制；（b）ICT 機制；（c）PET 機制；（d）ESIPT 機制；（e）AIE 機制。Fig.1 Schematic diagram of fluorescence response mechanism.（a）FRET mechanism.（b）ICT mechanisms.（c）PET mechanism.（d）ESIPT mechanism.（e）AIE mechanism.

圖2 活性酶原位成像和非原位成像對比示意圖。（a）熒光探針用于原位成像與非原位小鼠組織成像對比；（b）細胞內活性酶與探針共價（上圖）或非共價原位成像對比（下圖）。Fig.2 Schematic diagram of enzyme in situ imaging.（a）In situ and non-in situ probe mouse tissue imaging.（b）Cell enzyme and probe covalent（top）or non-covalent in situ imaging（bottom）.

綜上，本文將主要探討近幾年分子熒光探針用于檢測酶的活性以及原位成像的設計策略，并對這些策略進行匯總，希望對該領域的研究者們提供一些啟發。

3 分子熒光探針原位檢測活性酶設計策略

分子熒光探針是在生理條件下檢測和成像生物重要酶活性的寶貴工具，這些成像試劑大多依賴于酶刺激時熒光強度或發射波長的變化來報告酶活性。與大分子試劑相比，小分子具有更高的細胞滲透性和代謝性。然而，生命物體不同于實驗室環境中穩定的和嚴密測試的溶液，是高度動態和開放的系統；小分子探針容易在生物體內擴散，導致信號背景比下降。為了提高熒光團在目標酶及其附近的保留時間，一些設計策略隨之被開發。這些策略可以簡單地分為共價方法和非共價方法。第一種是在酶促作用下探針形成反應中間體，酶蛋白結構中的親核基團進攻探針形成的反應中間，兩者以共價鍵的形式連接，減少了熒光染料的擴散，進而實現原位成像。第二種方案是利用酶裂解連接劑使得熒光探針的水溶解度降低，熒光團通過聚集或自組裝非共價成鍵方式停留在活性位點附近。因此，本文將主要針對這兩種探針設計策略，探究蛋白酶原位成像技術的研究進展。

3.1 基于（酰氧基）甲基酮反應基團的分子熒光探針

（酰氧基）甲基酮（（Acyl oxygen）methyl ketones,AOMKs）探針是一種與半胱氨酸蛋白酶發生反應脫去AOMKs 反應基團與蛋白酶形成硫酯共價鍵，常用于開發半胱氨酸蛋白酶的抑制劑以及相應的活性探針，活性探針的開發原理是通過形成共價鍵達到成像的能力[41-42]。

2007 年，Bogyo 團隊利用以上成像原理首次開發了可“開關”的組織蛋白酶小分子近紅外熒光探針[43]。探針成功地對小鼠活體在腫瘤、肝臟、脾臟和腎臟組織中標記了相同的三種組織蛋白酶，并通過組織蛋白酶抑制劑處理成像進行了驗證；該研究表明AOMKs 反應基團可以引入原位分子熒光探針用于半胱氨酸蛋白酶的檢測。隨著半胱氨酸蛋白酶的AOMKs 抑制劑轉化為小分子活性探針（Active base probes,ABPs）的研究不斷進行，Bogyo 團隊篩選了半胱氨酸蛋白酶抑制劑庫，設計了關于類泛素化蛋白酶（Sentrin specific proteases,SENPs）的含AOMKs 反應基團的抑制劑以及活性檢測探針GB137（圖3（a））[44]。含有Cy5 染料的AOMK 探針對hSENPs 的標記效果較好（圖3（b）），同時也證明了探針是由于hSENPs 活性位點半胱氨酸的修飾擁有的標記能力，可以作為SENP 的高選擇性探針。隨后，該團隊為丁香假單胞菌產生的分泌木瓜蛋白酶樣Ⅲ型效應物——AvrPphB 合成了一種AOMK 探針[45]，開發了一種熒光強度更好的熒光團FH11，用來更好地識別標記蛋白酶。至此AOMKs 基團修飾分子熒光探針用于生物成像的可行性得到了證明，小鼠實驗的成功說明該類探針具有用于半胱氨酸蛋白酶原位成像的潛力。

圖3 （a）探針GB137 與組織蛋白酶原位成像的響應機理；（b）探針用于原位標記活體荷瘤小鼠生物成像［44］。Fig.3 （a）Response mechanism of probe GB137 and cathepsin in situ imaging.（b）Optical in situ imaging of cathepsin with probe GB137 in mice tumors，bright-light images［44］.

同樣地，Drag 團隊研發了標記組織蛋白酶B的分子熒光探針用于蛋白酶的可視化成像和檢測（圖4（a））[46]。該團隊為了設計蛋白酶選擇性底物，使用了兩個化學庫分析組織蛋白酶B 在P4-P1的位置偏好，實現這些底物可以不被其他類型組織蛋白酶水解。然后將選擇性底物轉化為AOMK反應基團的抑制劑，最后用Cy5/Cy7 熒光染料進行修飾得到探針。實驗證明，通過增加一個ahx連接器可以增加探針的保留能力以及組織蛋白酶L 和S 的標記，含有Cy5 染料的探針MP-CB-2 相比于Cy7 可以被腫瘤細胞吸收并對組織蛋白酶B 有較高的選擇性（圖4（b））；隨后通過18 個不同的癌細胞株發現探針對組織蛋白酶B 的選擇性較好，并發現探針信號和組織蛋白酶L 抗體染色在被測細胞系中有很大的重疊，這表明組織蛋白酶B 和L 具有相同的內溶酶體區，而且還驗證了A-431 細胞的細胞核中存在組織蛋白酶B。該探針雖然無法進行熒光的“開關”，但從生物細胞的成像結果上證明了AOMKs 基團應用于分子熒光探針進行原位成像的能力。

AOMKs 對半胱氨酸蛋白酶有較高的選擇性，目前眾多科研團隊選擇該類反應基團進行半胱氨酸蛋白酶活性探針以及抑制劑的開發[47-48]。AOMKs 現在更多用于相關抑制劑的開發中，抑制劑轉化為活性探針的進程也在持續更新；目前熒光發射標記類的探針由于熒光發射光譜的重疊，限制了平行檢測和可視化的酶的數量，從而限制了它們在多參數分析中的應用[49]。同時，該探針對其他酶的特異性表達能力弱，僅適合用于半胱氨酸蛋白酶的成像與標記。

3.2 基于Aza 醌甲基反應中間體的分子熒光探針

在以往的研究中，Aza 醌甲基結構適用于生物滅活劑[50-51]，隨著科研人員的不斷探索，以香豆素衍生物作為熒光團基本框架的分子熒光探針開發出來。這類探針在酶的作用下形成高活性醌甲基反應中間體，然后由目標酶或附近蛋白質的親核殘基進行邁克爾加成，以共價錨定激活位點周圍的熒光團實現原位成像功能；這種探針設計策略在糖苷酶、磷酸酶、類固醇硫酸酯酶等熒光成像中得到了應用[52-54]。Yao 團隊開發了一類用于胱天蛋白酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspases）以及蛋白質酪氨酸磷酸酶（Protein tyrosine phosphatases,PTP）的Aza 醌甲基反應中間體熒光探針[55]，所得到的熒光探針通常處于“關閉”狀態，在這種狀態下，熒光團因為FRET 效應被猝滅劑有效猝滅（圖5（a））。由于設計分子尺寸較大，需要提前進行細胞滲透，在引入到細胞和酶對酶底物的裂解后，1,6-消除反應導致猝滅劑離去，探針釋放熒光和醌甲基中間體。P1 探針對胱天蛋白酶具有良好的響應，P6 探針可以對PTP 進行雙光子成像（圖5（b）、（c））。隨后，該課題組在探針P5 基礎上加入細胞穿透肽（CPP）以解決滲透問題。該類探針通過利用這種中間體的反應性和擴散性，實現足夠酶定位的空間分辨率，能夠不滅活目標酶，允許在原位放大目標信號。該實驗對醌甲基探針的作用機制進行了較好的闡述，也表明醌甲基結構應用于分子熒光探針仍然有著優異的生物相容性。

圖5 （a）猝滅型活性探針的設計及其原位標記活性酶的機理；（b）P1 探針在凋亡HeLa 細胞中原位檢測caspase-3/7 活性的共聚焦熒光圖像；（c）P6 探針在HeLa 細胞中單光子和雙光子成像［55］。Fig.5 （a）Overall design principle of the quenched activity-based probes（qABPs）.（b）Confocal images of caspase-3/-7 activities using P1 in apoptotic HeLa cells and confirmed with immunofluorescence staining.（c）Confocal images of PTP1B overexpressed HeLa cells with P6 under two-photon excitation（800 nm）and one-photon excitation（543 nm）［55］.

Withers 團隊于2011 年發表了含雙氟基團的Aza 醌甲基中間體可以原位固定的檢測糖苷水解酶的分子熒光探針（圖6（a））[56]。雙氟甲基結構相對于單氟結構有較好的水溶性、便捷的合成路徑以及較高的原位標記[57]。該類探針可以用于農桿菌β-葡萄糖苷酶/半乳糖苷酶（Beta-glucosidase/galactosidase,Abg）的生物成像，表明醌甲基結構探針廣泛的生物應用，對于人體病原體感染探針原位成像也有著較好的借鑒。隨后該團隊于2018 年在原來研究的基礎上發表了一個非特異性的唾液酸酶分子熒光探針（T1，圖6（b））以及一個特異性流感病毒神經氨酸酶（NA）成像的分子熒光探針（T8，圖6（b））[58]，可以近距離連接的試劑在唾液酸酶/神經氨酸酶作用后在酶周圍環境共價標記。T1 探針對MDCK 細胞的內源性唾液酸酶有較好的熒光標記，在抑制劑N-乙酰-2,3 脫氫-2-脫氧神經氨酸（N-acetyl-2,3-dehydrogen-2-deoxyneuraminic acid,DANA）作用下信號有所降低。由于T1 探針的非特異性，無法區分唾液酸酶的類型，在檢測流感病毒感染的MDCK 細胞的NA和唾液酸酶時，使用NA 抑制劑奧司他韋信號沒有降低，而DANA 效果較好，這表明細胞標記是由于唾液酸酶導致的（圖6（c））。在唾液苷部分的C4 和C7 位置引入甲基可以增加探針的選擇性[59]，在使用奧司他韋以及DANA 處理后，T8 探針的熒光效果有所減弱，說明該探針是NA 特異性底物（圖6（c））。實驗結果充分說明了醌甲基探針在生物成像上的廣泛應用，對于植物以及動物病原體侵入的原位成像以及診斷具有巨大潛力。

圖6 （a）含雙氟甲基探針結構式及其檢測農桿菌β-葡萄糖苷酶/半乳糖苷酶（Abg）作用原理［56］；（b）神經氨酸酶探針T1和T8 的設計結構及其原位熒光標記酶的作用機制；（c）T1 探針（c1）以及T8 探針（c2）在流感病毒感染后對MDCK 活細胞內神經氨酸酶的原位熒光成像照片［58］。Fig.6 （a）The structure of the probe containing difluoromethyl and its mechanism for detecting Abg［56］.（b）The structure and its mechanism of T1 and T8 for in situ detection of neuraminidase.（c）Confocal images of influenza-infected MDCK cells after incubation of T1（c1）and T8（c2）probes［58］.

根據上述機理，Xie 團隊設計了檢測γ-谷酰基轉肽酶（GGT）的自固定近紅外分子熒光探針[60]。在GGT 作用下探針在715 nm 處熒光信號顯著增強，實現了在活體小鼠中對GGT 特異性可視化成像。響應后的分子可以因共價作用保留在腫瘤內增大熒光效果時間，對GGT 可以進行免洗以及實時熒光成像。探針與傳統設計一樣由識別基團、連接劑以及熒光團三個部分組成，含有甲基的氨基甲酸乙酯作為離去基團使得反應后少量羥甲基化HD 染料A2 成為Aza 醌甲基反應中間體，引入兩性離子增加探針的水溶性。探針熒光被對氨基苯酚連接劑猝滅，在GGT 作用下水解得到不穩定中間體釋放氨基甲酸乙酯形成Aza 醌甲基中間體，與GGT 周圍的蛋白質親核基團攻擊，形成共價鍵釋放熒光信號。在活體小鼠實驗中，探針對腫瘤組織以及肝臟和腎臟具有GGT 活性的組織器官都有熒光信號釋放。相比對照組，醌甲基自固定熒光探針有著較好的原位成像以及較高的熒光信號，也說明了該類探針在生物成像以及進行深入腫瘤診斷的發展潛力。

研究表明衰老時表達相關β-半乳糖苷酶（Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-Gal），且衰老細胞可能會隨著年齡的增長而積累，因此相關的熒光探針也開發出來[61-62]。Cui 團隊開發了一種用于檢測藥物誘導體內衰老的自固定分子近紅外熒光探針（圖7（a）、（b））。Aza 醌甲基中間體與酶親核基團結合，實現了更長時間的保留，雙氟甲基相對于單氟甲基的加入增強了原位近紅外信號的強度，為SA-β-Gal 酶提供了新的分子熒光探針策略[63]。該團隊使用喜樹堿（CPT）處理，誘導HeLa 細胞的細胞衰老，在未處理細胞及處理細胞成像以及沖洗后成像證實了雙氟結構具有良好的原位近紅外成像能力（圖7（c））。在小鼠實驗中，經過CPT 處理的相比于接受生理鹽水處理的對照組的腫瘤熒光強度明顯增加，具有相同的實驗結論（圖7（d））。該探針利用近紅外熒光團以及原位共價自固定方式對細胞衰老相關糖苷水解酶進行原位檢測，為檢測SA-β-Gal 酶提供了一個新的思路，也為相關領域的研究提供了較好的觀察方法。

圖7 （a）NIR-BG1 和NIR-BG2 探針結構及其對化療誘導的體內衰老進行無創傷成像機理；（b）探針NIR-BG1 和NIRBG2 的體外光譜學性能；（c）探針在HeLa 細胞內對SA-β-Gal 原位熒光成像照片；（d）CPT 處理的小鼠腫瘤模型原位熒光成像，NIR-BG1（上）或NIR-BG2（下）［63］。Fig.7 （a）The structures and their noninvasive imaging mechanism of chemotherapy-induced senescence in vivo using probe NIR-BG1 or NIR-BG2.（b）Photophysical properties of NIR probes NIR-BG1 and NIR-BG2.（c）Confocal images of HeLa cells incubated with NIR-BG1 or NIR-BG2.（d）Live animal in situ imaging of CPT-treated HeLa xenografts mice after tail vein injection of NIR-BG1（top）or NIR-BG2（bottom）［63］.

3.3 基于反應基團的重氮茚酮和識別基團用于轉基因酶

通過羅丹明與重氮茚酮結構的結合與修飾開發出了一系列可以應用于生物細胞活體成像的熒光染料。Hell 團隊設計了五種羅丹明N=N 結構染料，染料可以被常見光源激活，這類結構染料可以與蛋白質結合，重氮茚酮籠化基團的尺寸減小導致籠化染料的結構緊湊，有利于穿透細胞膜，光激活可以方便地生成一個無害的二氮分子作為離去基團[64]。該團隊初步證明了這類探針的響應機制，并對探針的生物應用進行了一定的評估。受到上述啟發，Rivera-Fuentes 團隊通過這種存在生物相容性、熒光發射波長長以及與蛋白質結合有巨大潛力的染料[65]，對結構進行修飾得到雙激活的高分辨率熒光探針，并對該探針作用機制以及生物原位成像應用進行了測試（圖8（a））。該設計方案是利用重氮茚酮的光激活發生沃爾夫重排，使得熒光團的熒光發射更強，同時烯酮中間體與酯酶發生共價反應連接實現原位成像能力。小分子探針首先受到酶促作用對酚羥基去乙酰化，使得抑制熒光作用減弱。同時在不同激發波長光的照射下，所得到的中間體結構也不一樣。該團隊選用了適合人體的激發波長405 nm，在該波長激發光的照射下發生沃爾夫重排，得到的烯酮中間體可以在酯酶及其附近發生共價反應，減少在細胞內的擴散達到原位成像水平（圖8（b））。該團隊探索了雙激發重氮茚酮結構在生物細胞體內的作用機制，表明了該類結構用于原位檢測活性酶的能力，同時為羅丹明染料作為生物熒光染料提供了一個新的發展方向。隨后，該團隊再次開發了對硝基還原酶進行檢測的重氮茚酮結構的分子熒光探針[66]。探針本身以及在被硝基還原酶催化硝基芳香族化合物還原為苯胺后沒有熒光發射，在激發光照射后，重氮茚酮結構發生沃爾夫重排得到烯酮中間體發出熒光。實驗中看出熒光產物會受到吸電子基團硝基的抑制，中間體與酶的蛋白親核片段發生共價反應，該中間體在極性溶劑中有較高的量子產率，減少了和水以及亞硝基的親核反應的概率，增大了原位成像的能力。這次實驗不僅展示了這類探針強大的原位成像能力，同時通過聚焦共定位實驗論證了硝基還原酶主要存在于線粒體中且分布不均勻。

圖8 （a）酯酶和光照雙激活原位分子熒光探針的響應機制；（b）探針與HeLa 細胞孵育后不同波長激光激發共定位成像［65］。Fig.8 （a）Response mechanism of double-activated in situ small molecule fluorescent probes.（b）Colocalization imaging of HeLa cells with probe 1 after photoactivation（b1）and before photoactivation（b2），line profile（dashed green line in b2）（b3）［65］.

利用重氮茚酮與羅丹明染料的修飾思路已經得到了一些具有生物相容性潛力的新型熒光染料，并且借助光激活后的烯酮中間體與蛋白質親核基團的共價反應實現原位成像減少分子擴散，這些策略對今后開發重氮茚酮類的分子熒光探針有所幫助和啟發。設計研究時也需要考慮生物大環境中水分子這種含量最多的親核試劑對這類探針的影響，可以通過改變環境溶劑極性大小對熒光強度變化進行選擇[67]。酶促反應與光激活需要同時進行，這也是探針臨床轉化的一項挑戰。

3.4 基于構象變化引起的電子轉移機制

不可逆抑制劑可以通過較強的共價鍵形式與酶蛋白中的基團結合，研究人員利用該性質，在熒光團、不可逆抑制劑以及抑制結合劑的基礎上進行合適的化學修飾，在酶的作用后使探針發生構象變化，得到新型原位成像分子熒光探針。

Peng 團隊合成了用于檢測環氧合酶-2（COX-2）用于區分炎癥、腫瘤以及正常細胞的分子熒光探針[68]，探針在基于化學修飾的吲哚美辛（Indomethacin,IMC）與硝基苊醌（Nitro benzoquinone,NANQ）熒光團的連接，選擇一種線性烷基二胺作為連接劑，在一端與吲哚美辛形成酰胺鍵，在另一端與熒光團形成仲胺鍵（圖9（a））。在COX-2 缺失的親水環境下，探針處于平面折疊狀態，此時結構能量最低，并且由于NANQ 與IMC 兩平行平面之間的電子轉移（PET）熒光被猝滅；在COX-2 過表達的炎癥和癌癥中探針的抑制劑會識別結合這種氧化還原酶，分子部分進入酶狹窄的疏水空腔內，導致構象被迫展開，熒光恢復[69]。體外測試中，該探針展現了在不同COX-2 濃度下熒光發射波長的變化。由于環境親水性以及疏水性的改變，在疏水性環境中探針發射波長為526 nm，在親水性環境中發射波長為595 nm。并且通過小鼠癌癥組織以及炎癥組織成像，在綠色通道（（555 ± 20）nm）中小鼠癌細胞組織熒光增強，在紅色通道（（615 ± 20）nm）中小鼠炎癥組織熒光顯色增強（圖9（b）），證明探針具有區分癌細胞以及炎癥的能力。后面的小鼠成像進一步證實了這個觀點，同時也表明了探針在應用于術中導航的潛力。隨后，該團隊選用塞來昔布作為抑制劑、萘酰亞胺作為熒光團以及阿司匹林作為抑制劑、萘酰亞胺作為熒光團對COX-2 進行檢測[70-71]。

圖9 （a）構象變化引發電子轉移的NANQ-IMC6 探針熒光檢測機制；（b）裸眼熒光引導下腫瘤切除術的操作圖片：（b1）小鼠體內腫瘤成像，（b2）紫外線照射下肉眼可見腫瘤切除情況［68］。Fig.9 （a）The mechanism of the probe NANQ-IMC6 via conformational change triggering electron transfer.（b）Possibility of naked eye fluorescence-guided resection of tumors：（b1）imaging tumors in vivo，（b2）visualization of tumor resection by the naked eye under ultraviolet illumination［68］.

Lv 團隊依照上述策略設計了IMC 作為抑制結合劑、近紅外七甲氨酸菁作為熒光團[72]、己二胺作為連接劑的近紅外分子熒光探針，并成功對肺纖維化細胞以及小鼠模型的COX-2 可視化。這種策略利用不可逆抑制劑與酶的高度選擇性和共價結合以及活性COX-2 酶作用探針誘發空間構象，改變控制PET 作用影響熒光“開關”，減少了因為抑制劑降低酶的活性導致探針熒光處于總是打開的狀態，提高探針的原位成像能力。

這類探針展示了一種新型活性酶共價原位結合方式，利用不可逆抑制劑的特異性選擇以及高強度共價結合能力、己二胺良好的延展性以及分子間距對PET 機制影響，設計出針對COX-2 氧化還原酶高效生物原位成像的分子熒光探針。但是該類探針目前僅針對COX-2 進行了大量設計，其他類型的酶還沒有太多相關報道，后期需要對其他不可逆抑制劑進行篩選，對其他酶的結構進行分析，設計出熒光團與抑制劑較好的結合方式。

3.5 基于酶促作用的固態熒光團原位沉淀

固態熒光成像是原位成像的一種常見策略，相較于水溶性熒光團易擴散至整個細胞，固態熒光團有著較好的沉淀能力，在酶促作用實現原位沉淀后，熒光團能在活性酶附近快速沉淀積累，增強原位熒光信號，降低背景信號，從而提高最終的原位成像分辨率。

Tan 和Zhang 團隊基于不溶于水的聚集誘導發射發光物質（AIEgens）——2-（2′-羥苯基）-4（3氫）-喹唑啉酮（HPQ）結構的基礎上，研發了新型固態熒光團HTPQ（圖10）[73]，該熒光團的響應機制是激發態分子內質子轉移（ESIPT）。該熒光團有以下特點：（1）有著較大的斯托克斯位移，這不僅有利于熒光成像，還可以增加靈敏度，降低背景信號；（2）高度不可溶性降低了分子擴散有利于沉積，實現了原位成像的能力，染料在固態情況下有著強烈的熒光；（3）熒光團的不可溶性和強烈熒光可以被消除。并以此設計了堿性磷酸酶（ALP）的熒光探針，對酚羥基進行保護阻止ESIPT 機制，達到抑制熒光實現“開關”的功能，探針表現出了較好的原位實時成像能力；同時還能夠監測兩種骨肉瘤細胞系（U-2OS 和Saos-2）中的ALP 活性。這是首次利用HPQ 固態熒光團進行分子熒光探針的設計，為非共價原位成像探針設計提供了一個嶄新的策略。Yang 團隊在HPQ 的基礎上設計了針對乙酰膽堿酯酶（AChE）、丁酰膽堿酯酶（BChE）、糜蛋白酶（Chy）、羧酸酯酶1&2（Carboxylesterase 1&2,CE 1&2）的固態熒光探針用于追蹤殘留農藥[74]，該探針對活體細胞、斑馬魚以及新鮮蔬菜中的代表性有機磷和氨基甲酸酯類農藥表現出良好的檢測能力，也為分子熒光探針在更多領域應用提供了新思路[75]。

圖10 （a）探針HTPQA 的設計策略以及對堿性磷酸酶響應機制；（b）探針HTPQA 在不同濃度的堿性磷酸酶時熒光發射光譜；（c）HTPQA 在HeLa 細胞的實時熒光成像［73］。Fig.10 （a）The design and response mechanism of the probe HTPQA to ALP.（b）The fluorescence emission spectra of HTPQA in the presence of different concentrations of ALP in TBS buffered solution.（C）Real-time imaging of HeLa cells incubated with HTPQA［73］.

HTPQ 的量子產率相對HPQ 有所下降，同時四苯乙烯結構的較大空間位阻使得HTPQ 難以設計其他酶的探針，于是Zhang 團隊再次開發了一種基于AIE機制的固態ESIPT發射用于檢測細胞內溶酶體酶——β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase,GLU）的可“開關”分子熒光探針[76]，并引用供電子原子硫合成出新型自組裝小分子固態熒光團HDPQ（圖11（a））。探針識別GLU 后發生酶促作用，酚羥基去保護，熒光團HDPQ 在溶酶體內通過氫鍵作用發生自組裝且激活熒光信號（圖11（b））。接著，組裝分子熒光團在溶酶體內固態沉積，保持原位性，從而具有長期原位成像以及檢測GLU 的能力（圖11（c）、（d））。而且由于溶酶體處于酸性環境，熒光團的熒光信號會因此受到限制，熒光團HDPQ 則表現出較低的pH 靈敏度，這也為開發相應的溶酶體酶的分子熒光探針提供了一個新的思路。隨后，該團隊在此基礎上提出將HPQ 融合到簡單的半花氨酸共軛體系上，構建了一系列可活化、高穩定性的近紅外Ⅱ區J 聚集體，克服了傳統J 聚集體對載體的依賴，可以在體內進行原位自組裝[77]。通過近紅外Ⅱ區J聚集體設計探針HPQ-Zzh-B，并在近紅外Ⅱ區成像導航，實現腫瘤的長期原位成像和精確腫瘤切除以及減少肺轉移。這一策略將推動可控近紅外Ⅱ區J聚集和體內精確生物成像的發展。

圖11 （a）探針HDPQ-GLU 的化學結構及其與溶酶體酶GLU 的反應機制；（b）探針HDPQ-GLU 的體外光譜學性質；（c）LPS 誘導L02 細胞炎癥中細胞內GLU 的熒光圖像；（d）活斑馬魚在不同時期GLU 變化的熒光成像［76］。Fig.11 （a）Chemical structure of the HDPQ-GLU and its response mechanism with GLU.（b）Fluorescence emission spectra of HDPQ-GLU after incubating with GLU in MES buffer.（c）Fluorescence images for detecting intracellular GLU after different incubation times in L02 cells.（d）Fluorescence imaging of GLU in living zebrafish at different periods［76］.

固態熒光團原位沉淀的開發是期望保留分子熒光探針毒性小、可代謝等優點的同時，能減少小分子熒光團在細胞組織內的擴散，延長保留時間，達到更好的原位實時成像能力。對于現有的商業固態熒光染料進行修飾改性，也是較為常見的開發生物相容性的新型熒光團以及探針的有力方法。

ESIPT 機制的運用可以有效地增大熒光團的斯托克斯位移，加入供電子基團進行結構修飾改性也可能在增大斯托克斯位移上有所幫助[78]，這些是在新型固態熒光團進行初步篩選以及后期改性修飾需考慮的因素。可自組裝的固態熒光團需要考慮氫鍵等分子相互作用后的結構，設計結構穩定以及鍵長較短（小于0.35 nm，π-π 作用越小越強）的自組裝結構也是需要考慮的。

3.6 基于酶促作用發生原位自組裝的納米結構

2004 年，小分子作為酶的底物進行自組裝得到了驗證[79]。受到上述啟發，科研人員將該想法引入分子熒光探針設計中，通過酶促作用，探針以非共價鍵形式（如靜電作用、氫鍵、π-π 作用、范德華力和疏水作用）實現自組裝，在生物活性酶及其周圍附著形成納米結構，達到原位成像的能力[80]。Rao 團隊研發了一種檢測接受化療后腫瘤細胞凋亡過程的小分子自組裝熒光探針[81]，用于區分腫瘤化療過程的陰性和陽性反應（圖12（a））。小分子具有易滲透、生物分布范圍廣等優勢，借助小分子在細胞內生物正交環化反應持續控制自組裝形成納米熒光顆粒，實現細胞組織成像。體外自組裝的納米顆粒在細胞內無熒光信號，證明納米聚集在細胞內發生，探針可以發生原位納米聚集，增大保留時間。探針對化療有效的腫瘤細胞以及組織發生分子內大環化，探針轉化大環化分子達到90%，由于阿霉素（DOX）化療作用腫瘤細胞凋亡時胱天蛋白酶-3/7 被激活，切割L-DEVD capping肽，通過分子間疏水相互作用p-p 堆疊聚集并高度成像（圖12（b）、（c）），其他酶的選擇性測試都表明探針對胱天蛋白酶-3/7 有高度特異性表達。探針的熒光強度與腫瘤化療后的大小有著直接關系，這提供了治療對個體療效的有力信息。該探針初步實現了生物體內腫瘤化療效果的檢測，為判斷腫瘤化療療效提供了一個新的思路，也展現了分子熒光探針在生物應用中的巨大潛力。

圖12 （a）探針C-SNAF 在人腫瘤異種移植小鼠模型中caspase-3/7 活性的體內成像機制；（b）探針在細胞中自組裝熒光納米聚集體的3D-SIM 成像；（c）探針對荷瘤小鼠細胞凋亡的無創成像［81］。Fig.12 （a）The mechanism of imaging caspase-3/7 activity by C-SNAF in tumor xenograft mouse models.（b）3D-SIM imaging of self-assembled fluorescent nanoaggregates in cells.（c）Non-invasive imaging of apoptosis in tumor-bearing mice［81］.

Sun 團隊利用聚乙二醇化可以精確將小分子染料NIR-Ⅱ探針從單分子組裝到納米顆粒大小，并研究了尺寸與熒光/藥代動力學之間的關系[82]。Ye 團隊設計了基于小分子可激活近紅外熒光以及核磁共振雙模塊探針用于分子成像[83]，選用細胞膜上過度表達的堿性磷酸酶（ALP）作為靶點，探針可以被ALP 激活定位細胞膜組裝納米顆粒。

近期，Li 團隊設計了一種生物活性體內組裝（Bioactivatedin vivoassembly,BIVA）熒光探針（圖13（a））[84]，該探針不僅具有主動靶向機制，而且在酶作用探針后發生聚集組裝誘導保留（Aggregation assembly induces retention,AIR）效應進行原位納米纖維組裝。該探針有以下幾個較好的設計思路：（1）將探針模塊化設計，一共設計了5 個模塊，每一個模塊對應一個功能。該組在探針分子M1 基礎上對相應模塊進行裁剪和替換，設計出非對應性反應斷裂模塊分子M2、無成像模塊分子M3、斷裂模塊反應的R-M1、非對應性靶向模塊的M4、無斷裂模塊以及成像模塊的M5、無成像模塊并且斷裂模塊發生反應后的R-M3，這六類分子用于各模塊功能機制證明。（2）選擇聚乙二醇作為長期循環模塊，增加了分子在水溶液中的親水性以及延長探針在血液傳輸中的保留時間，讓探針有更多的機會在腫瘤細胞周圍滲透聚集。（3）酶切作用后探針疏水性增加以及表面氫鍵暴露，促進自組裝形成β-折疊納米結構纖維（圖13（b）），探針納米纖維化在腫瘤細胞膜周圍附著積累，減少分子的擴散以及代謝問題從而增加了熒光信號在腫瘤組織的保留時間，實現了腫瘤的原位實時成像（圖13（c）、（d））。最終結果證明，該探針雖然是模塊化設計，但最終的性能表現較為優異。成纖維細胞活化蛋白-α（FAP-α）對探針分子具有高度特異性識別，有利于探針在腫瘤內的酶切以及自組裝；相對于傳統主動靶向機制的熒光探針，這種主動靶向機制以及AIR 效應的聯合作用對于延長探針成像窗口期有著一定的啟發。

圖13 （a）BIVA 探針的化學結構及其在活體中檢測機理圖；（b）探針在水溶液中自組裝結構表征；（c）探針BIVA 與MIA PaCa-2 細胞后形成具有主動靶向性的熒光圖像；（d）探針在小鼠模型中的熒光成像及代謝情況［84］。Fig.13 （a）Chemical structure and detection mechanism of bioactivated in vivo assembly（BIVA）probe.（b）Assembled structure conformations and self-assembly behavior in aqueous solution.（c）Confocal images of the probe with active targeting property in MIA PaCa-2 cells.（d）The time-dependent NIR fluorescence image of mice bearing MIA PaCa-2 cells after intravenous administration of ICG，M2 and M1［84］.

自組裝形成納米結構降低了小分子擴散造成的背景信號，這種策略也逐漸應用于光聲成像、核磁成像等領域[85]。隨著可控自組裝的發展，科研人員可以通過控制自組裝實現控制熒光信號強度，達到聚集誘導猝滅、聚集誘導發射、可調控的單體-外聚體轉變等熒光信號變化，一些新型自組裝分子熒光探針技術也隨之被開發[86]。該策略保留了小分子的特性，增加了探針的多功能化（如抑制腫瘤細胞擴散等），同時一定程度上避免了大分子納米探針直接注射的一些問題（如網狀內皮系統吸收，導致腫瘤組織內分布不均，并可能對肝、脾和肺有毒性）[87]。

4 總結與展望

酶的活性與各項生命活動有著重要的關系，酶表達水平的變化與一些疾病有著一定的關聯，能夠將這種酶含量清晰直白地展現出來是現代醫學一直面臨的挑戰。分子熒光探針的出現與發展為現代醫學以及其他方向提供了一個較好的工具，理想的分子熒光探針具有靈敏度高、選擇性好、時空分辨率高、生物相容性好等優點，這些性質保證了分子熒光探針可以精確地反映酶的活性和表達水平。

原位成像能力的探索是獲得優秀時空分辨率分子熒光探針的有效策略之一，通過不同的方式（共價鍵或者非共價鍵形式）連接或者附著在活性酶及其周圍，減少分子的擴散，增加保留時間，提高探針的原位概率。近紅外熒光染料的應用是目前研究的熱點，熒光團能激發/發射波長更長的熒光，有利于減少光損傷以及增加熒光的組織穿透深度，近紅外Ⅱ區可以進行精細組織結構的清晰成像[88-96]，使該領域得到了進一步發展。通過現有已被臨床批準的藥物，如亞甲基藍、吲哚菁綠等通過修飾轉化為高效的熒光探針，可能是提高探針進入臨床實驗幾率的一種方案。為了解決生物組織散色光強烈的問題，雙光子乃至三光子分子熒光探針的設計策略受到了關注[97]。分子熒光探針的開發與發展，各種熒光成像技術的迭代更新以及核磁共振成像、超聲成像等成像技術與熒光成像技術的結合應用，進一步提升了酶的檢測分辨率[98]。其他的設計思路也在不斷探索中，例如光激活等雙方式激活探針、利用熒光探針進行疾病的診斷治療一體化等。希望未來能有更多的設計策略應用于分子熒光探針的開發，多領域的研究者們增加交流合作并達成共識，努力將分子熒光探針帶入臨床轉譯以及后期應用，為人類在生命領域的探究提供有力的工具。

本文專家審稿意見及作者回復內容的下載地址：http://cjl.lightpublishing.cn/thesisDetails#10.37188/CJL.20230128.