多酶體系中谷胱甘肽HPLC 分析方法研究

張浩月，穆玉敏，秦浩杰，楊夢茜，劉麗榮，任麗梅

（1.美邦美和生物科技有限公司，河北 石家莊 050000；2.石家莊學(xué)院 化工學(xué)院，河北 石家莊 050035;3.河北省生物制藥國際聯(lián)合研究中心，河北 石家莊 050035;4.河北省高校微生物制藥應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050035;）

0 引言

人類細(xì)胞質(zhì)中存在一種自然合成的三肽，由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，即還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，可維持細(xì)胞生物的正常功能，對正常的免疫系統(tǒng)功能起重要作用，并且具有解毒、抗氧化等、促生長、提高生物對不良環(huán)境影響的作用，廣泛用于酒精、藥物及其他各種原因?qū)е碌母螕p傷治療。

1921 年，英國生化學(xué)家發(fā)現(xiàn)了Hopkins 谷胱甘肽，從酵母抽提物中分離得到，并正式命名為glutathione；其后對GSH 的提取、分離及分析檢測方法等方面進行了研究。生產(chǎn)谷胱甘肽有4 種方法，分別為溶劑萃取法、傳統(tǒng)化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶催化法。

在工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用最廣的是化學(xué)合成法和萃取法，目前酶催化法具有越來越高的研究價值。GSH工業(yè)化生產(chǎn)最早的方法是化學(xué)法合成法，其存在耗時長、污染大、成本高等缺點，制約了其進一步工業(yè)化的發(fā)展。近幾年，體外酶催化法是生產(chǎn)GSH的主要研究方向。

體外酶催化法是指利用酶來催化3 種氨基酸合成GSH 的方法，生產(chǎn)工藝相對簡單，是其最大的優(yōu)勢，且可有效消除反饋抑制，使GSH 有較高的產(chǎn)量。酶法合成GSH 的關(guān)鍵在于制備高性能的GSH 合成酶體系和高效率的ATP 再生體系。由于我國對谷胱甘肽鈉的關(guān)注較晚，故近幾年對還原型谷胱甘肽鈉研究分析是人們關(guān)注的熱點，測定谷胱甘肽鈉的含量采用的是紫外分光光度法，但準(zhǔn)確度不高，干擾嚴(yán)重；毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析法優(yōu)點在于可實現(xiàn)快速檢測，精密度及準(zhǔn)確度較高，但對操作要求較高；藥典介紹了測定谷胱甘肽片HPLC 法，C18 色譜柱（十八烷基硅烷鍵合硅膠填充）；以磷酸鹽緩沖液為流動相（稱取磷酸二氫鈉6.8 g，庚烷磺酸鈉2.2 g，加水1 000 mL 使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值3.0）-甲醇（96∶4），檢測波長為210 nm。此方法可有效分離L-半胱氨酸、L-谷氨酸鈉、甘氨酸、ATP、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽等，但檢測時長為40 min，不利于日常分析檢測。故匹配新工藝的發(fā)展，開發(fā)新的快速檢測且有效的分離方法是至關(guān)重要的。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀P230Ⅱ，大連依利特分析有限公司。

電子天平AUW220D，賽多利斯儀器有限公司。

pH 計Seven2 Go S2，梅特勒-托利多儀器有限公司。

還原型谷胱甘肽，阿拉丁，純度99%。

氧化型谷胱甘肽，阿拉丁，純度99%。

L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物，麥克林，純度99%。

L-谷氨酸鈉一水合物，麥克林，純度99%。

甲醇為色譜純，科密歐，99.9%。

四丁基硫酸氫胺meilunbio；純度99%。

1.2 實驗方法

1.2.1 流動相

0.05mol/L 磷酸氫二鈉-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀-8 mmol/L 四丁基硫酸氫銨(pH 值為4.5)-甲醇(V/V=80∶20)

1.2.2 色譜條件

色譜柱：島津Wonda Cract ODS-2 (4.6×250 mm，5 μm)。

流速：1.0 mL/min。

波長：214 nm。

柱溫：30 ℃。

進樣量：10 μL。

洗脫時間：15 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

使用島津Wonda Cract ODS-2 色譜柱，分別使用以下3 種洗脫體系進樣檢測：

（1）0.028 mol/L 磷酸二氫鉀(pH 值為3.0)-甲醇(V/V=95∶5)。

（2）[0.028 mol/L 磷酸二氫鉀-10 mM 庚烷磺酸鈉(pH2.5)]-甲醇(V/V=96∶4)。

（3）[0.05 mol/L 磷酸氫二鈉-0.05mol/L 磷酸二氫鉀-8 mmol/L 四丁基硫酸氫銨(pH 值為4.5)]-甲醇(V/V=80∶20)。

當(dāng)采取洗脫體系（1）時，L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸鈉、甘氨酸分離度差，三峰不能分離，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果如圖1 所示。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果Fig.1 Test result of the mixed reference solution

當(dāng)采取洗脫體系（2）時，ATP 鈉鹽的保留時間40 min，不利于實際分析應(yīng)用。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果如圖2 所示。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果Fig.2 Test result of the mixed reference solution

當(dāng)采取洗脫體系（3）時，ATP 出峰時間縮短約為13 min，干擾少，峰形良好，且L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸鈉、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽之間分離度R 分別為2.21、5.03 和2.55，均＞1.5；甘氨酸與L-半胱氨酸鹽酸鹽之間分離度1.25，＞1.0，表明各組分可較好分離，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果如圖3 所示。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果Fig.3 Test result of the mixed reference solution

2.2 線性關(guān)系考察

（1）準(zhǔn)確稱取還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，置于25 mL 容量瓶，用流動相溶解定容至刻度，搖勻得還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 mg/kg。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋至0.01、0.05、0.10、0.25 和0.50 mg/kg，搖勻備用。

（2）準(zhǔn)確稱取氧化型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，置于25 mL 容量瓶，用流動相溶解定容至刻度，搖勻得氧化型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 mg/kg。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋至0.000 2、0.000 5、0.002 0、0.005 0 和0.010 mg/kg，搖勻備用。

（3）準(zhǔn)確稱取L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，置于25 mL 容量瓶，用流動相溶解定容至刻度，搖勻得L-半胱氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 mg/kg。取上述對標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋至0.000 5、0.001 0、0.002 5、0.005 0 和0.010 mg/kg，搖勻備用。

（4）準(zhǔn)確稱取L-谷氨酸鈉一水合物標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，置于25 mL 容量瓶，用流動相定溶解容至刻度，搖勻得L-谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mg/mL。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋至0.025、0.050、0.20、0.50 和1.0 mg/kg，搖勻備用。

（5）準(zhǔn)確稱取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，置于25 mL 容量瓶，用流動相定溶解容至刻度，搖勻得甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mg/mL。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋至0.025、0.050、0.10、0.20 和0.50 mg/kg，搖勻備用。

分別取上述各組分搖勻備用的稀釋液于0.45 μm 水系濾膜過濾后，進行HPLC 檢測，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進樣濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制5 組標(biāo)準(zhǔn)曲線。

線性關(guān)系測試結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系測試結(jié)果Table 1 Result of linear relationship test

由表1 可以看出，GSH 在（0.01～ 0.5）mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好。方法檢出限為0.2 ng，方法定量限為0.6 ng。

2.3 精密度和回收率試驗

在“1.2”項色譜條件下，取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進樣6 次，觀察各組分峰面積的RSD 及各標(biāo)準(zhǔn)品回收率。各組分峰面積的RSD 均＜2.0%（n=6），表明儀器精密度良好；不同加標(biāo)濃度測得樣品的回收率在94.6%～110.0%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果見表2。

表2 精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果Table 2 Result of the precision and spiked recoveries

2.4 樣品含量測定

反應(yīng)液中還原型谷胱甘肽含量測定，1 h 反應(yīng)結(jié)果如圖4 所示。

圖4 1 h 反應(yīng)結(jié)果Fig.4 Reaction result of 1 h

反應(yīng)液中還原型谷胱甘肽含量測定，2 h 反應(yīng)結(jié)果如圖5 所示。

圖5 2 h 反應(yīng)結(jié)果Fig.5 Reaction result of 2 h

反應(yīng)液中還原型谷胱甘肽含量測定，3 h 反應(yīng)結(jié)果如圖6 所示。

圖6 3 h 反應(yīng)結(jié)果Fig.6 Reaction result of 3 h

反應(yīng)液中還原型谷胱甘肽含量測定，4 h 反應(yīng)結(jié)果如圖7 所示。

2.5 反應(yīng)轉(zhuǎn)化率計算

（1）L-半胱氨酸鹽酸鹽轉(zhuǎn)化生成還原型谷胱甘肽的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率計算式如下：

（2）依據(jù)不同取樣時間L-半胱氨酸鹽酸鹽轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽的轉(zhuǎn)化率結(jié)果，繪制對應(yīng)還原型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化率曲線，表明該反應(yīng)較為迅速，2 h 時轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到85%，考慮后續(xù)實驗需求，在反應(yīng)2 h 時即可終止反應(yīng)。樣本轉(zhuǎn)化率見表3。

表3 樣本轉(zhuǎn)化率Table 3 Conversion rate of the samples

不同時間樣品轉(zhuǎn)化率如圖8 所示。

圖8 不同時間樣品轉(zhuǎn)化率Fig.8 Conversion rate of samples at different times

3 結(jié)語

研究初期，依據(jù)常用緩沖鹽體系及藥典提及添加庚烷磺酸鈉離子對的方法進行了嘗試。常用緩沖鹽磷酸二氫鉀體系，對反應(yīng)底物L(fēng)-半胱氨酸、L-谷氨酸鈉、甘氨酸不能完全分離。藥典方法雖然可以實現(xiàn)目標(biāo)峰可完全分離，但檢測時間較長，不利于日常分析檢測；所以2 種方法均不能達(dá)到實驗?zāi)康?。本方法針對多酶體系中各組分含量檢測建立，與藥典方法相比，縮短檢測時長，且對體系中各組分均可定量檢測。此方法應(yīng)用初期，甘氨酸、L-半胱氨酸兩物質(zhì)出峰時間較近，后期針對緩沖鹽體系的pH 值及有機相比例進行調(diào)整。經(jīng)過驗證，優(yōu)化后的方法分離度更高、簡便快捷，可以用于生成還原型谷胱甘肽反應(yīng)液中GSH、GSSG、Gly、L-Cys、L-Glu、AMP、ADP、ATP 含量的測定，以及轉(zhuǎn)化率的計算，對實際生產(chǎn)有重要的指導(dǎo)意義。