種植方式對‘赤霞珠’葡萄酒發酵中酵母菌多樣性的影響

劉俊妤，郭方圓，孫悅*

（寧夏大學葡萄酒與園藝學院，寧夏銀川 750021）

近年來，葡萄種植模式對釀酒微生物和葡萄酒品質的影響逐漸成為研究熱點。由于消費者對食品安全和健康問題的關注度增加，“可持續性”理念將成為葡萄酒進入市場的先決條件[1]，有機葡萄酒市場在全球范圍內呈上升趨勢[2]，葡萄種植者和消費者均對有機葡萄酒，尤其是生物動力葡萄酒的生產表現出越來越高的興趣[3-4]。

目前，葡萄的種植方式有常規種植、有機種植和生物動力種植。常規種植中，一般使用合成化肥、殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等進行田間管理[5]。有機種植則限制了這些合成制品的使用，種植過程中避免使用合成化肥和農藥、轉基因生物及其產物和其他合成添加劑，主要依靠堆肥、有機肥、菌肥等方法來提高葡萄園的土壤活力和生態多樣性[6]。生物動力種植強調葡萄園的整體性和生物多樣性，在各項田間管理的時間上使用特定的生物動力制劑，刺激土壤養分循環，采用特定的天文學日歷進行施肥、修剪、播種等活動[7-8]。在有機葡萄酒和生物動力葡萄酒中，適應環境條件的本土酵母非常重要，它們直接影響葡萄酒的風土特征[9-10]，促進微生物多樣性的形成，使葡萄酒保留典型的感官特征，并具有更復雜的風味[11]。

不同種植模式影響葡萄表面及葡萄園中的酵母菌群結構[12]。研究表明，有機葡萄栽培提高了葡萄和葡萄園的微生物群落多樣性[13-14]。Hendgen等[15]在德國的長期試驗中發現，在有機葡萄栽培中，采用覆蓋植被等措施會影響表層土壤的真菌群落組成，使表土細菌生物多樣性增加，而不會影響其物種豐富度。Radi?等[16]研究發現，與常規管理相比，有機管理下葡萄藤和相關雜草根器官的真菌內生菌定殖、物種豐富度、多樣性指數更高。Setati等[17]從南非傳統種植和生物動力種植相鄰的葡萄園中采集葡萄樣品，發現生物動力葡萄園展示了獨特的生物多樣性和豐富的物種構成。然而，我國葡萄酒行業的有機栽培和生物動力法栽培剛剛起步，這些種植模式對本土葡萄酒微生物的影響鮮見報道，因此研究不同種植模式下酵母菌多樣性差異對葡萄酒質量的提高具有重要意義。

本研究采用WLN培養基形態學鑒定和26S rDNA D1/D2區序列分析，以賀蘭山東麓銀川產區有機種植、生物動力種植和常規種植模式下的‘赤霞珠’葡萄為原料，分析其自然發酵過程中酵母菌群的動態變化，旨在明確不同種植模式對葡萄酒發酵過程中酵母菌群的影響，以期為葡萄種植模式的選擇和本土酵母菌株的開發與利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

原料來自寧夏賀蘭山東麓銀川產區2020年份的‘赤霞珠’葡萄，設置有機種植（ORG）及常規種植對照組（ORGc），生物動力種植組（BND）及常規種植對照組（BNDc）。因有機種植（106°27′E，38°06′N）和生物動力（106°26′E，38°31′N）種植園區相距較遠，故每種模式都設有對照。常規種植葡萄園按照產區葡萄園管理規范進行管理，如使用殺蟲劑等預防葡萄疾病，施用化肥，采用清耕法除草等；有機種植近5年來按照國家“有機產品”標準[18]要求進行管理；生物動力種植近五年來按照“Demeter生物動力認證”[19]要求進行管理。

培養基及主要試劑：WLN營養瓊脂培養基、YPD培養基（青島高科技工業園海博生物技術有限公司）；引物NL1和NL4（上海生工生物工程股份有限公司）；DNA裂解液（2% Titiov 1% SDS、10 mmol Tris、1 mmol EDTA、100 mmol NaCl）；TE緩沖液；IMTris（pH=7.5）；0.5 mol·L-1EDTA（pH=8.0）；RNase；10×PCR Buffer（含Mg2+）；Taq Plus DNA聚合酶；50×TAE。

主要儀器：高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-50FBS），上海申安醫療器械廠；電泳儀（DYY-6C），北京六一生物科技有限公司；電泳槽凝膠成像儀（DYCP-32B），北京六一儀器廠；PCR儀（844-0069），德國耶拿分析儀器股份公司；全自動凝膠成像儀（Champ Gel 15000），北京賽智創業科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄汁發酵試驗

每個葡萄園隨機采集45 kg健康、無破損的葡萄，并在采集當天置于冷凍盒中運回實驗室，在無菌環境下破碎后，每15 kg放于10 L發酵罐（發酵體積為8 L）中進行發酵，添加60 mg·L-1焦亞硫酸鉀、30 mg·L-1果膠酶，5～6 ℃浸漬48 h，然后26～28 ℃控溫發酵，采用CO2失重法監控發酵過程（連續兩天失重為0.1 g視為發酵結束）。3個發酵重復。

1.2.2 酵母菌分離、純化與保藏

在破碎的第0、2、4、6、8天（發酵結束）5個時期取樣，根據不同時期選用各自合適的稀釋梯度在WLN培養基上進行涂布，添加青霉素抑制細菌生長，于28 ℃培養3～5 d，根據菌落的菌株形態選取50～60個酵母單菌落進行純化；純化后的酵母菌使用YPD液體培養基進行活化，活化菌液置于20%的無菌甘油中，-80 ℃條件下保藏備用。

1.2.3 酵母菌26S rDNA D1/D2區分子鑒定

酵母菌DNA的提取采用石英砂破壁法。酵母菌的26S rDNA D1/D2區序列擴增參考Wang等[20]的方法進行，具體的PCR擴增體系與擴增程序如下。

PCR 擴增體系（ 25 μL ） ： 引 物N L 1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）各0.5 μL，10×Easy Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，10×Easy Taq Buffer Polymerase 0.25 μL，酵母菌DNA模板1 μL，加ddH2O至25 μL。

PCR擴增程序：95 ℃下預變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min ，72 ℃延伸80 s，循環36次；72 ℃保溫8 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳（電壓110 V，電流90 mA，時間約40 min）進行檢驗。

將PCR擴增產物送至生工（上海）生物工程股份有限公司進行測序。測序結果與NCBI數據庫進行同源性對比。

1.3 數據處理

試驗數據使用Excel進行統計分析，繪圖使用軟件Origin 2021。

2 結果與分析

2.1 基本理化指標

按照葡萄酒國家標準[21]測定了未發酵葡萄醪及其發酵結束時樣品的基本理化指標（表1）。由表1可知，4組樣品葡萄醪的含糖量分別為223.00、224.67、226.33、223.00 g·L-1，且BND的含糖量最高，ORG和BNDc的含糖量最低。4組樣品發酵結束時的含糖量均低于4.0 g·L-1，表明樣品均已完成酒精發酵，ORGc酒精度最高（13.68%），BND的酒精度（12.85%）最低。BND的糖-酒精轉化率明顯低于其他組，推測其發酵過程中副產物占比較大，有篩選出低產乙醇酵母的可能，后續可以做其釀酒特性的相關研究。葡萄醪的總酸總體在4.09～4.50 g·L-1，pH在3.50～3.90。發酵結束時，ORG和ORGc的總酸有較為明顯的升高，BND和BNDc的總酸變化較小，pH總體在3.80～3.95。

表1 葡萄醪及其發酵結束時葡萄酒的基本理化指標Table 1 Basic physicochemical indexes of grape must and final wine

2.2 酵母菌WLN形態學鑒定結果

本研究于不同種植模式、不同發酵時期共分離出1075株酵母菌。根據WLN瓊脂培養基上所表現出的特點，將所有酵母菌初步分為16個類型（I～XⅥ），結果見圖1，菌株菌落形態及數量統計見表2。

圖1 WLN培養基上酵母菌種的不同形態Figure 1 Different morphologies of yeasts on WLN medium

表2 酵母菌的WLN形態特征及分類結果Table 2 WLN morphological characteristics and classification results of yeast

在不同種植模式下分離出的酵母菌的WLN類型及其數量差異較大。由表2可知，ORG共有264個菌落，其中類型Ⅷ和Ⅻ的數量最多，均是51株，分別占分離自ORG總菌株的19.32%；類型Ⅵ和XⅣ數量最少，分別是1株和2株。ORGc共有276個菌落，其中類型Ⅸ的數量最多，共56株酵母菌，占分離自ORGc總菌數的20.29%；數量最少的是類型XⅢ，只有2株。BND共有264個菌落，其中類型Ⅸ的數量最多，共47株酵母菌，占分離自BND總菌數的17.80%；數量最少的是類型Ⅳ、XⅢ和XⅥ，均有1株。BNDc共有271個菌落，其中類型Ⅺ的數量最多，共50株酵母菌，占分離自BNDc總菌數的18.45%；數量最少的是類型XⅣ，只有1株。

2.3 26S rDNA D1/D2區序列分析

對W L N 形態鑒定出來的1 6 個類型，在不同種植條件下自然發酵的各時期隨機選取1～3株代表菌株進行26S rDNA的D1/D2區測序鑒定。結果表明，測序菌株PCR片段大小為486～626 bp。經26S rDNA D1/D2區序列分析被歸為8屬9種（表3），分別為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）、假絲酵母（Candida zemplinina）、拜爾接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、桃梅奇酵母（Metschnikowia fructicola）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、隱球酵母（Cryptococcus saitoi）、庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、單孢釀酒酵母（Kazachstania bulderi）。其中，釀酒酵母在WLN培養基上表現出6種菌落形態（分別為Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、X、Ⅺ、XⅡ），葡萄汁有孢漢遜酵母和隱球酵母在WLN培養基上表現出2種菌落形態（分別為I、Ⅱ和XⅢ、XⅣ），而C.zemplinina、Z.bailii、M.pulcherrima、M.fructicola、P.kudriavzevii和K.bulderi這6種酵母菌均只表現出1種形態（分別對應WLN類型中的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、XⅤ、XⅥ）。

表3 測序菌株片斷大小及與相關菌株的序列相似性Table 3 Size of the fragment and sequence similarity to related strains

2.4 自然發酵各階段酵母群落結構演替及差異比較

由圖2 可見，在未發酵的葡萄醪中，O RG 有6種酵母菌，其中H.uvarum為優勢酵母，占酵母總數的33.33%；而S.cerevisae、C.zemplinina、M.pulcherrima、M.fructicola、C.saitoi占比分別為16.67%、12.50%、12.50%、4.17%和20.83%。ORGc有7種酵母菌，其中H.uvarum為優勢酵母，占酵母總數的33.33%；而Z.bailii、C.saitoi、M.fructicola、M.pulcherrima、C.zemplinina、S.cerevisiae占比分別為2.78%、13.89%、8.33%、19.44%、11.11%和11.11%。BND有6種酵母菌，H.uvarum、S.cerevisiae兩種酵母占比最高，均占酵母總數的25.00%；而Z.bailii、C.saitoi、C.zemplinina、M.pulcherrima占比分別為4.17%、4.17%、20.83%和20.83%。BNDc有6種酵母菌，H.uvarum占酵母總數的25.81%為優勢酵母；P.kudriavzevii、M.pulcherrima、C.saitoi、C.zemplinina、S.cerevisiae占比分別為19.35%、9.68%、12.90%、22.85%和9.68%。

圖2 不同種植模式處理下不同時期酵母菌種屬占比Figure 2 Proportion of yeast species in different periods under different vineyard managements

在葡萄酒發酵過程中，不同酵母菌種屬的比例表現出較大差異。ORG在第0天以非釀酒酵母為主，從第2天開始，釀酒酵母菌株開始占據主導地位，H.uvarum還有一定占比，第4、6、8天以釀酒酵母占據絕大多數，完全取代非釀酒酵母；ORGc在第0天以非釀酒酵母為主，在第2天釀酒酵母占比上升到43.3%，非釀酒酵母菌占比明顯高于ORG，從第4天到第8天，釀酒酵母為優勢酵母，第4天占比90%以上，第6天、第8天占比達到100%；BND在第0天、第2天均以非釀酒酵母為主，在第4天釀酒酵母占主導地位，但是非釀酒酵母仍有21.7%的占比，第6天、第8天釀酒酵母占比達到100%；BNDc在第0天、第2天均以非釀酒酵母為主，在第4天，釀酒酵母占主導地位，非釀酒酵母只有13.3%的占比，第6天釀酒酵母占比達到100%，第8天釀酒酵母占比98.3%。

3 討論與結論

本研究從寧夏賀蘭山東麓銀川產區的有機種植、生物動力種植與常規種植模式的‘赤霞珠’葡萄自然發酵樣品中共分離到1075株酵母菌，采用WLN培養基形態分類和26S rDNA D1/D2區序列分析進行了菌種鑒定。將其歸為8屬9種，分別是H.uvarum、C.zemplinina、Z.bailii、M.pulcherrima、M.fructicola、S.cerevisae、C.saitoi、P.kudriavzevii、K.bulderi。值得關注的是，與此前該產區分離出的酵母結果相比[22-23]，有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、酵母屬（Saccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、假絲酵母屬（Candida）較為常見，而拜爾接合酵母（Z.bailii），以及單孢釀酒酵母（K.bulderi）鮮見報道。在常規種植模式下，葡萄醪中發現的Z.bailii酵母通常對許多不利條件具有極強的耐受性，例如高滲透壓、低pH和各種食品防腐劑[24]，有較大可能性存活于使用化學合成試劑的常規種植模式，因其對乙醇更敏感[25]，所以在酒精發酵過程中減少，釀酒酵母成為優勢菌種。相關研究表明，在生物動力種植模式下，葡萄發酵第4天新增的酵母菌K.bulderi能夠在低pH條件下依靠葡萄糖和δ-葡萄糖酸內酯有效生長，這種獨特性使K.bulderi成為低pH發酵過程的理想菌種[26]。

與陳學蓮等[27]研究相比，在同一生物動力種植模式下，兩研究均分離出了9種酵母菌，酵母菌多樣性水平相近，但除H.uvarum和S.cerevisae外，其他7種酵母均不相同，表明酵母菌種類在兩年份之間存在較大差異。在常規種植模式下，本研究分離出6種酵母菌，比陳學蓮等[27]的結果少1種，但M.pulcherrima、H.uvarum和S.cerevisae酵母菌均被分離出，表明常規種植模式下，兩年份之間酵母菌種類差異小。

本研究中，不同種植模式下的葡萄自然發酵中的酵母群落結構有一定的差異，尤其是生物動力種植模式對‘赤霞珠’葡萄酒發酵中的酵母多樣性具有積極影響。生物動力種植組的酵母菌多樣性最高，該種植模式下的葡萄酒自然發酵過程中出現了7屬7種酵母菌，即S.cerevisiae、H.uvarum、C.zemplinina、M.pulcherrima、C.saitoi、Z.bailii和K.bulderi。Bagheri等[28]也發現，生物動力種植中分離出的酵母多樣性更高，與本研究結果類似。

本文探究了寧夏賀蘭山東麓產區3種種植模式下的‘赤霞珠’葡萄在自然發酵過程中的酵母菌群演替，為利用有機種植、生物動力種植葡萄酒的生產提供了理論依據。后續可進一步研究有機種植模式和生物動力種植模式對‘赤霞珠’葡萄酒的酵母菌代謝產物和香氣成分等發酵特性的影響，為葡萄種植模式的選擇和本土酵母的開發利用提供更多依據。