TMV、CMV和PVY三重?zé)晒舛縋CR同步檢測方法的建立

白靜科 牛龍龍 吳彥輝 李建華 李小杰 李成軍 李淑君

摘 ?要：為建立同時(shí)檢測煙草普通花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY）的多重?zé)晒舛縋CR方法，本研究根據(jù)GenBank中TMV、CMV及PVY的CP基因保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，并對反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，建立了可同時(shí)檢測TMV、CMV和PVY的三重?zé)晒舛縋CR方法，并評價(jià)了該方法的敏感性、特異性、重復(fù)性及準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，建立的方法中TMV、CMV和PVY的檢測下限分別為2.60×10、1.25×10、2.33×10?copies/μL，檢測靈敏度比普通PCR法提高10倍；該方法可特異性檢測出TMV、CMV和PVY，但煙草蝕紋病毒（TEV）、煙草脈帶花葉病毒（TVBMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）無法檢出且無交叉反應(yīng)，批內(nèi)與批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于1.5%，24份樣本檢測結(jié)果中TMV、CMV和PVY的陽性檢出率分別為75%、100%和41.67%，且三重?zé)晒舛縋CR方法與普通單重PCR方法得出一致的檢測結(jié)果。結(jié)果表明本研究建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測方法具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，可為后續(xù)TMV、CMV和PVY的病害診斷與流行調(diào)查提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：煙草普通花葉病毒；黃瓜花葉病毒；馬鈴薯Y病毒；三重?zé)晒舛縋CR

中圖分類號：S435.72???????????????????????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ?????????????????????文章編號：1007-5119（2023）05-0055-07

Establishment of a Triplex?Fluorescent Quantitative PCR for Simultaneous Detection of?TMV， CMV and PVY

BAI Jingke， NIU Longlong， WU Yanhui， LI Jianhua， LI Xiaojie， LI Chengjun， LI Shujun

（1. Key Laboratory for Green Preservation & Control of Tobacco Diseases and Pests in Huanghuai Growing Area/Tobacco Research Institute， Henan Academy of Agricultural Sciences， Xuchang，?Henan 461000， China; 2. Xuchang Branch of Henan Provincial Tobacco Company， Xuchang，?Henan 461000， China）

?To establish a multiplex fluorescent quantitative PCR for the detection of tobacco mosaic virus （TMV）， cucumber mosaic virus （CMV） and potato virus Y （PVY）， specific primers and probes were designed based on the conserved CP gene sequences of TMV， CMV and PVY， respectively. And the reaction system was optimized， subsequently the sensitivity， specificity， repeatability and accuracy were evaluated. Results showed that the detection limit for TMV， CMV and PVY was 2.60×10， 1.25×10， 2.33×10copies/μL， respectively. The detection sensitivity was 10 times higher than the conventional PCR method. No cross-reaction was found with tobacco etch virus （TEV）， tobacco vein banding mosaic virus （TVBMV） and tomato spotted wilt virus （TSWV）. The coefficient of variation between intra-assay and inter-assay were both under 1.5%. By using the triple fluorescent quantitative PCR， 24 samples were detected and the positive rate of TMV， CMV and PVY was 75%， 100%， 41.67%， respectively， which were consistent with the single-PCR. In conclusion， a specific， stable and accurate triple fluorescent quantitative PCR was established and could be used for diagnosis and epidemiological investigation of TMV， CMV and PVY.

?TMV; CMV; PVY; triplex fluorescent quantitative PCR

基金項(xiàng)目：河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新項(xiàng)目（2023ZC023）；河南省煙草公司重點(diǎn)項(xiàng)目（2023410000240021）；許昌市煙草公司科技項(xiàng)目（2021411000240104）

作者簡介：白靜科（1990-），女，助理研究員，碩士，主要從事煙草植物保護(hù)研究。E-mail：baijingke@126.com。通信作者，E-mail：13603749396@126.com

收稿日期：2023-04-20?????????????????修回日期：2023-06-14

煙草是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物，病毒病是煙草的主要病害。煙草上常見的病毒主要有煙草普通花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、煙草蝕紋病毒（TEV）和煙草脈帶花葉病毒（TVBMV）等。煙草病毒病田間癥狀復(fù)雜多樣，經(jīng)常多種病毒復(fù)合侵染，單純依靠發(fā)病癥狀難以識別。因此，對煙草病毒進(jìn)行快速有效檢測，對預(yù)防和控制煙草病毒病具有重要意義。

免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法深受煙草病毒檢測學(xué)者們的青睞。免疫學(xué)方法中的酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay，?ELISA）在煙草病毒檢測上應(yīng)用較廣泛，但存在耗時(shí)長、干擾因素多、易出現(xiàn)假陽性等缺點(diǎn)；分子生物學(xué)方法中的反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)（RT-PCR）因其靈敏度高等特點(diǎn)經(jīng)常被應(yīng)用于煙草病毒檢測中；而熒光定量PCR（qRT-PCR）方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可對樣品實(shí)時(shí)快速定量檢測等優(yōu)點(diǎn)，已被運(yùn)用于多種植物病毒的有效檢測中。

目前生產(chǎn)上主要通過截?cái)酂煵莶《静鞑ネ緩綄ζ溥M(jìn)行預(yù)防。TMV主要通過農(nóng)事操作等機(jī)械摩擦方式進(jìn)行傳播，CMV和PVY主要通過帶毒蚜蟲刺吸煙株方式進(jìn)行傳播，傳播方式不同將導(dǎo)致防治方法的差異，對其進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定與精準(zhǔn)預(yù)測是首要措施。因此，本研究利用TaqMan探針熒光定量PCR法能夠在同一反應(yīng)體系中檢測多種目標(biāo)基因的特點(diǎn)，擬建立TMV、CMV和PVY的三重?zé)晒舛縋CR同步檢測方法，以期提高病毒檢測效率，為煙草病毒病的有效診斷和精準(zhǔn)防控提供技術(shù)手段。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與試劑

TMV、CMV、PVY、TEV、TVBMV及番茄斑萎病毒（TSWV）樣本均保存于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，用于驗(yàn)證試驗(yàn)的煙草病毒樣本采自所試驗(yàn)田。

Trizol（Invirtogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit、Premix Taq酶、DNA凝膠回收試劑盒Mini BEST Agarose GEL DNA Extraction Kit和pMDTM 18-T Vector均購自寶生物工程（大連）有限公司；感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.2 ?儀器與設(shè)備

ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（美國ABI公司）；D30紫外分光光度計(jì)（Eppendorf公司）；凝膠成像儀（Bio-Rad公司）；T100 PCR儀（Bio-Rad公司）；盧湘儀TGL-16M型高速冷凍離心機(jī)。

1.3 ?引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的TMV（AJ239099.1）、CMV（EF417579.1）和PVY（EU719650）的外殼蛋白（coat protein，?CP）基因序列，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并利用NCBI中的Primer-BLAST進(jìn)行比對，保證所設(shè)計(jì)引物的特異性，引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列見表1。

1.4 ?煙草總RNA的提取

分別取0.1?g TMV，CMV，PVY病毒樣本，Trizol法提取總RNA，提取方法參照說明書。所提RNA的濃度由分光光度計(jì)測定，其完整性由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選/在1.8～2.1的RNA樣本保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ?重組質(zhì)粒的制備與鑒定

以上述TMV，CMV和PVY的RNA為模板，Oligo dT Primer為引物，合成cDNA，然后通過常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包括：10 μL Premix Taq酶，0.5 μL的10 μmol/L上下游引物，2 μL的cDNA模板，7 μL的ddHO。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；35個(gè)循環(huán)包括95 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、30 s；最后是72 ℃，10 min。純化回收PCR產(chǎn)物并與pMD18-T Vector連接，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入Trans 5α，藍(lán)白斑篩選后進(jìn)行測序鑒定。重組質(zhì)粒濃度經(jīng)測定后計(jì)算得到TMV、CMV和PVY重組質(zhì)粒濃度拷貝數(shù)，分別為7.80×10、3.76×10、6.99×10?copies/μL。

1.6 ?三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系優(yōu)化

反應(yīng)體系的優(yōu)化方法參照文獻(xiàn)[23]，分別以TMV、CMV和PVY的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板做單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)，然后逐漸增加反應(yīng)重?cái)?shù)，并利用矩陣法對引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立熒光定量PCR最佳反應(yīng)體系。

1.7??標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將TMV、CMV和PVY的重組質(zhì)粒分別按照10倍倍比稀釋8個(gè)梯度，得到10、10、10、10、10、10、10、10數(shù)量級拷貝數(shù)，模板選用3種重組質(zhì)粒等體積混合溶液，利用1.6中優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，并利用Excel繪制，軸為重組質(zhì)粒模板濃度對數(shù)，軸為值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 ?檢測靈敏性試驗(yàn)

將TMV、CMV和PVY的重組質(zhì)粒分別按照10倍倍比稀釋至10～10共9個(gè)梯度，以每種質(zhì)粒終濃度等體積混合為模板，利用1.6中優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)分別以3種病毒的梯度重組質(zhì)粒為模板，利用表1中的引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，比較兩種方法的檢測靈敏性。

1.9 ?檢測特異性試驗(yàn)

參照1.4中方法提取TEV、TVBMV和TSWV樣本總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，同時(shí)以無酶水為陰性對照，利用1.6中優(yōu)化后的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件擴(kuò)增，驗(yàn)證該方法是否具有特異性。

1.10 ?重復(fù)性試驗(yàn)

等體積混合TMV、CMV和PVY重組質(zhì)粒的8個(gè)濃度梯度，模板選取此質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.6中優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)濃度均進(jìn)行3次批內(nèi)和批間重復(fù)，并計(jì)算批內(nèi)和批間的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.11??檢測準(zhǔn)確性驗(yàn)證

分別利用建立的TMV、CMV和PVY三重?zé)晒舛縋CR方法與TMV、CMV和PVY的普通單重PCR方法（擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[13]中的表1），對采自煙草研究所試驗(yàn)田的24份煙草病毒樣本進(jìn)行檢測。

2 ?結(jié) ?果

2.1??三重?zé)晒舛縋CR最佳反應(yīng)體系

引物及探針經(jīng)矩陣法優(yōu)化后，得到TMV、CMV及PVY的上下游引物及探針的最優(yōu)濃度分別為0.2和0.8 μmol/L，0.3和1.0 μmol/L，0.2和0.6 μmol/L。優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件為：95 ℃、30?s，95 ℃、5?s，57 ℃、15?s，72 ℃、30 s，共45個(gè)循環(huán)。

2.2 ?3種重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以TMV、CMV和PVY的3種重組質(zhì)粒等體積混合為模板，經(jīng)熒光定量PCR擴(kuò)增后，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度10～10?copies/μL范圍內(nèi)，值同質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間線性關(guān)系良好，可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的軸是重組質(zhì)粒模板濃度的對數(shù)，軸是值，其中TMV的標(biāo)準(zhǔn)曲線是=?3.289+40.324（=0.997，Eff=101.39%）（圖1），CMV的標(biāo)準(zhǔn)曲線是=?3.165+40.102（=0.997，Eff=107.01%）（圖2），PVY的標(biāo)準(zhǔn)曲線是=?3.106+ 36.367（=0.997，Eff=109.85%）（圖3），參照標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算待檢樣品中TMV、CMV與PVY的含毒量。

2.3 ?檢測方法的靈敏性比較

在三重?zé)晒舛縋CR檢測方法中（圖4），當(dāng)TMV、CMV和PVY的混合模板梯度分別為10?copies/μL時(shí)，無明顯擴(kuò)增曲線，表明TMV的最低檢出模板拷貝濃度為2.60×10?copies/μL，CMV的最低檢出模板拷貝濃度為1.25×10?copies/μL，PVY的最低檢出模板拷貝濃度為2.33×10?copies/μL，而在普通PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中（圖5），當(dāng)TMV、CMV和PVY的模板梯度分別為10?copies/μL時(shí)，1%瓊脂糖凝膠電泳圖中有明顯擴(kuò)增條帶，低于此濃度則無擴(kuò)增條帶，這表明普通PCR中TMV、CMV和PVY的檢測靈敏度分別是2.60×10、1.25×10和2.33×10?copies/μL。由此證明本試驗(yàn)建立的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法，靈敏度比普通PCR法提高10倍。

2.4 ?檢測方法的特異性

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖6），僅TMV、CMV及PVY出現(xiàn)特異的擴(kuò)增曲線，而對TEV、TVBMV、TSWV和陰性對照的擴(kuò)增均未出現(xiàn)明顯的相似曲線，因此，本研究建立的檢測方法有較強(qiáng)的特異性。

2.5??檢測方法的穩(wěn)定性

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的最大變異系數(shù)為0.81%，最小變異系數(shù)為0.06%；批間重復(fù)性試驗(yàn)的最大變異系數(shù)為1.28%，最小變異系數(shù)為0.40%，而這兩者的變異系數(shù)均處于1.5%以下，表明本研究建立的檢測方法具有良好的穩(wěn)定性與重復(fù)性。

2.6 ?檢測準(zhǔn)確率

利用建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測方法檢測煙草病毒樣本，并利用TMV、CMV和PVY的普通單重PCR方法對檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。檢測結(jié)果顯示，24份樣本中TMV、CMV和PVY的陽性檢出率分別為75%、100%和41.67%，且三重?zé)晒舛縋CR與普通單重PCR檢測結(jié)果一致，表明建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測方法準(zhǔn)確率較高。

3 ?討 ?論

精準(zhǔn)鑒別是有效控制病毒傳播與流行的首要和關(guān)鍵步驟，熒光定量PCR方法較其他病毒檢測方法具有系列優(yōu)點(diǎn)，如靈敏、特異、穩(wěn)定、可定量分析等，尤其是TaqMan探針法熒光定量PCR，由于探針與模板靶向結(jié)合釋放熒光信號，可顯著增強(qiáng)反應(yīng)特異性，實(shí)現(xiàn)對病毒核酸拷貝數(shù)的定量檢測。有研究發(fā)現(xiàn)，TaqMan熒光定量PCR的檢測下限通常能達(dá)到10～10?copies/μL，分別是SYBR Green ?染料法熒光定量PCR和普通PCR的100倍和1000倍。本研究建立的檢測方法對TMV、CMV和PVY的檢測靈敏度均可達(dá)到10?copies/μL，比普通PCR法提高10倍。

雖然TaqMan熒光定量PCR檢測技術(shù)存在諸多優(yōu)點(diǎn)，但在其推廣應(yīng)用中不得不考慮試驗(yàn)成本高的因素；鑒于此，學(xué)者們建立了多種病毒的多重?zé)晒舛縋CR方法，此類方法能在一次試驗(yàn)中通過同一反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)多病毒檢測，大幅縮短檢測時(shí)間，明顯降低試劑成本。在多重檢測體系中，須考慮多對引物和探針之間的相互干擾問題，而如何解決探針報(bào)告基因熒光發(fā)射波長問題，也是在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中必須兼顧的。本試驗(yàn)篩選大量引物和探針，并優(yōu)化了其反應(yīng)體系，最終將干擾降到最低，建立了TMV、CMV和PVY的三重?zé)晒舛縋CR同步檢測方法。

4 ?結(jié) ?論

本研究基于CP基因序列設(shè)計(jì)引物與TaqMan探針，建立了可同時(shí)檢測TMV、CMV及PVY三種病毒的多重?zé)晒舛縋CR檢測技術(shù)體系。所建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測體系中TMV最低檢出模板拷貝濃度為2.60×10?copies/μL，CMV的最低檢出模板拷貝濃度為1.25×10?copies/μL，PVY的最低檢出模板拷貝濃度為2.33×10?copies/μL，檢測靈敏度比普通PCR法提高10倍；檢測特異性較強(qiáng)，3種病毒間及與其他常見病毒間均無交叉反應(yīng)；準(zhǔn)確率高且重復(fù)性好，可提高病毒檢測效率，為煙草病毒病的診斷防治與預(yù)測預(yù)報(bào)提供技術(shù)手段。

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