廣州地區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌MIRU-VNTR位點(diǎn)與耐藥性變遷的關(guān)聯(lián)研究

劉振寧 劉志輝

廣州市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510095

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，每年大約1 000萬(wàn)結(jié)核病中約有50 萬(wàn)的利福平耐藥患者，其中78%對(duì)異煙肼也有耐藥性，即耐多藥結(jié)核病［1］。2020 年開始，全球耐多藥結(jié)核病的患者發(fā)病數(shù)呈上升趨勢(shì)，對(duì)21 世紀(jì)消除結(jié)核病的目標(biāo)構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［2-3］。國(guó)外有研究表明，很大比例的結(jié)核患者在接受化學(xué)藥物治療的過(guò)程中產(chǎn)生了耐藥性變化［4］，耐多藥北京結(jié)核菌株與耐藥表型之間存在很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性［5］。在耐藥結(jié)核高發(fā)區(qū)，大部分耐多藥患者通常由幾例密切相關(guān)的菌株產(chǎn)生耐藥性傳播引起，約占耐多藥結(jié)核病例的70%［6-7］。上述結(jié)果提示了耐多藥結(jié)核菌的成簇或許與其耐藥性變遷有關(guān)聯(lián)。結(jié)核分枝桿菌散在重復(fù)單元-數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（ycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat，MIRU-VNTR）廣泛用于結(jié)核分枝桿菌的基因分型，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），完全相同MIRU-VNTR譜型的結(jié)核分枝桿菌分離株可被聚類，以識(shí)別具有流行病學(xué)聯(lián)系的病例［8-9］。因此，菌株的耐藥性變遷是否可能與特定的VNTR 位點(diǎn)之間有關(guān)？為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們?cè)诖搜芯苛藦V州市胸科醫(yī)院Hunter-Gaston 指數(shù)（HGDI）大于0.6 的耐多藥結(jié)核分枝桿菌的16 個(gè)MIRU-VNTR 位點(diǎn)數(shù)據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

1.試驗(yàn)菌株

從廣州市胸科醫(yī)院菌株庫(kù)調(diào)取2011 至2015 年凍存的36 例患者共105 株耐多藥結(jié)核菌，其中每例患者含2～8 株耐多藥結(jié)核菌，以每例患者的第一株菌作為對(duì)照，其培養(yǎng)間隔范圍在3～1 229 d。菌株的來(lái)源：男性患者30 例，年齡范圍21～68 歲；女性患者6 例，年齡范圍25～39 歲。菌株置于孵育箱37 ℃孵育過(guò)夜，接種于7H10 米氏固體培養(yǎng)基（含10% OADC 增菌液）中傳代培養(yǎng)，4～6 周后收集菌落備用。我們分析了5 年期間在該數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有耐多藥結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性的臨床樣本。

本研究已經(jīng)廣州市胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，批準(zhǔn)文號(hào)：胸醫(yī)倫理（2019）24號(hào)。所有受試對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。

2.儀器與試劑

瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)BIO-RAD Molecular Imager Gel DocTM XR+Imaging system，美國(guó)伯樂(lè)公司）；PCR 擴(kuò)增儀（型號(hào)BIO-RAD C100TM Thermal cycler，美國(guó)伯樂(lè)公司）；瓊脂糖凝膠電泳儀（型號(hào)BIO-RAD Power PacTM Basic，美國(guó)伯樂(lè)公司）。DNA 染料（SYBR Gold，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；固體培養(yǎng)基粉末（Middlebroke 7H10，美國(guó)BD 公司）；增菌液（BBLTM Middlebrook OADC，美國(guó)BD 公司）；液體培養(yǎng)基粉末（Middlebrook 7H9，美國(guó)BD 公司）。PCR 擴(kuò)增試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）。Ezup柱式酵母基因組DNA 提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；瓊脂糖（Biowest 111860 Regular AGAROSE G-10，西班牙Biowest公司）。

3.方法

3.1.耐多藥結(jié)核菌DNA 提取 從105 株耐多藥結(jié)核菌的傳代培養(yǎng)物中提取其基因組DNA，具體操作按上述DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

3.2.耐多藥結(jié)核菌48 位點(diǎn)MIRU-VNTR 基因分型48 個(gè)MIRU-VNTR 位點(diǎn)通過(guò)各自對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［10］，具體操作按RNA 擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并測(cè)定每個(gè)擴(kuò)增子的重復(fù)單元（等位基因）的長(zhǎng)度。對(duì)于每個(gè)位點(diǎn)，分別使用結(jié)核分枝桿菌H37Rv 標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA 和去離子水作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。根據(jù)已知的研究方法提取耐多藥結(jié)核菌的DNA，并通過(guò)PCR 擴(kuò)增其目的基因片段［11］，確定重復(fù)單元的大小。對(duì)于在任一位點(diǎn)出現(xiàn)多條帶的菌株，重復(fù)PCR以確認(rèn)結(jié)果。

3.3.VNTR 多態(tài)性和HGDI 指數(shù)的分析 利用48 位點(diǎn)VNTR 最小可重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)，通過(guò)HGDI 指數(shù)計(jì)算各位點(diǎn)MIRU-VNTR 法的分辨力［12］。HGDI可作為評(píng)價(jià)VNTR位點(diǎn)分辨率高低的指標(biāo)。當(dāng)HGDI為0.00時(shí)，表明所有菌株無(wú)法區(qū)分，當(dāng)HGDI為1.00時(shí)，表明所有菌株被區(qū)分。HGDI指數(shù)小于0.3判斷為低分辨率，HGDI指數(shù)大于0.6判斷為高分辨率，HGDI 指數(shù)介于0.3～0.6 之間判斷為中等分辨率，具體HGDI 計(jì)算公式：HGDI=1-∑ nj（nj-1）∕N（N-1）；N 為菌株總數(shù)，S 為總類型數(shù)，nj 是第j 類型的菌株數(shù)［13］。本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)HGDI指數(shù)大于0.6的16個(gè)高分辨率VNTR位點(diǎn)進(jìn)行研究。

4.藥物表型與MIRU-VNTR位點(diǎn)變化的判斷標(biāo)準(zhǔn)

本文所用于研究的藥物表型有6 種（異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素、阿米卡星、左氧氟沙星和莫西沙星）。HGDI 指數(shù)大于0.6 的高分辨率MIRU-VNTR 位點(diǎn)有16 個(gè)：VNTR2401、VNTR0154、VNTR3192、VNTR0595、VNTR2461、VNTR2996、VNTR1305、VNTR2347、VNTR4348、VNTR0960、VNTR1907、VNTR4052、VNTR1895、VNTR2687、VNTR1955和VNTR4155。每位耐多藥結(jié)核復(fù)發(fā)患者均具有兩株以上的菌株，以各自患者第一株菌株為對(duì)照，與自身其他菌株作對(duì)比，菌株的藥物表型不一致判斷為表型有變化，藥物表型一致為無(wú)變化，菌株的VNTR 位點(diǎn)可重復(fù)單元拷貝數(shù)不一致判斷為該位點(diǎn)有變化，菌株的VNTR 位點(diǎn)可重復(fù)單元拷貝數(shù)一致判斷為該位點(diǎn)無(wú)變化。

5.統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。耐藥表型和VNTR位點(diǎn)之間的相關(guān)性使用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.耐多藥結(jié)核患者的臨床資料

在36 例耐多藥患者共105 株結(jié)核菌中，其中22 例患者（61.1%）發(fā)生耐藥性變遷（69 株），14 例患者（38.9%）未發(fā)生耐藥性變遷（36 株）。異煙肼耐藥表型變遷的結(jié)核菌有4 株（5.8%）：2 株（50.0%）由敏感變耐藥；2 株（50.0%）由耐藥變敏感。乙胺丁醇耐藥表型變遷有18 株（26.1%）：9 株（50.0%）由敏感變耐藥；9 株（50.0%）由耐藥變敏感。鏈霉素耐藥表型變遷有8 株（11.6%）：7 株（87.5%）由敏感變耐藥；1 株（12.5%）由耐藥變敏感。阿米卡星耐藥表型變遷有8 株（11.6%）：7 株（87.5%）由敏感變耐藥，1 株（12.5%）由耐藥變敏感。左氧氟沙星耐藥表型變遷有21 株（30.4%）：13 株（61.9%）由敏感變耐藥，8 株（38.1%）由耐藥變敏感。莫西沙星耐藥表型變遷有25株（36.2%）：16株（64.0%）由敏感變耐藥，9株（36.0%）由耐藥變敏感。

2.耐藥表型與MIRU-VNTR位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性

本研究采用χ2檢驗(yàn)分析耐藥表型與MIRU-VNTR 位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性。耐藥表型有變化組里，VNTR 位點(diǎn)有變化數(shù)為130 個(gè)，VNTR 位點(diǎn)無(wú)變化數(shù)為190 個(gè)；耐藥表型無(wú)變化組里，VNTR 位點(diǎn)有變化數(shù)為88 個(gè)，VNTR 位點(diǎn)無(wú)變化數(shù)為168 個(gè)；合計(jì)共576 個(gè)位點(diǎn)。耐藥表型與MIRU-VNTR 位點(diǎn)無(wú)顯著的關(guān)聯(lián)性（χ2=2.36；P＞0.05）。

3.耐藥表型變化種數(shù)與MIRU-VNTR 位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性（表1）

表1 耐多藥患者的耐藥表型變化種數(shù)與MIRU-VNTR位點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性

本研究共有6 種耐藥表型（異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素、阿米卡星、左氧氟沙星和莫西沙星）產(chǎn)生變化，將所有患者的每株耐多藥結(jié)核菌根據(jù)表型的變化種類數(shù)分為5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為耐藥表型無(wú)變化、1 種藥物變化、2 種藥物變化、3 種藥物變化和4 種藥物變化，1 種藥物變化指上述6 種藥物中任意1 種發(fā)生變化，以此類推，其中，耐藥表型無(wú)變化組-4種藥物變化組與VNTR 位點(diǎn)有顯著的關(guān)聯(lián)性（χ2=4.48；P＜0.05）。

4.耐藥表型的變化與高分辨率MIRU-VNTR 位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性（表2）

表2 6種抗結(jié)核藥物耐藥表型變化與16個(gè)MIRU-VNTR位點(diǎn)變化情況

將6 種耐藥變化的表型分別與16 個(gè)高分辨率MIRU-VNTR 位點(diǎn)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，乙胺丁醇耐藥表型與VNTR4348 位點(diǎn)（χ2=4.48，P＜0.05）、鏈霉素耐藥表型與VNTR0595 位點(diǎn)（χ2=4.76，P＜0.05）、莫西沙星耐藥表型與VNTR1907位點(diǎn)（χ2=5.08，P＜0.05）以及莫西沙星耐藥表型與VNTR1895 位點(diǎn)（χ2=4.72，P＜0.05）具有顯著的關(guān)聯(lián)性，其余組合的變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

討論

耐多藥結(jié)核病是全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，顛覆了結(jié)核病控制所取得的成就［14-15］。未來(lái)幾十年內(nèi)，高負(fù)擔(dān)國(guó)家的耐多藥結(jié)核患者人數(shù)預(yù)計(jì)將持續(xù)增加［16］。盡管涉及耐多藥結(jié)核病傳播的流行病學(xué)因素已為人所知，但其耐藥性變遷與VNTR 位點(diǎn)之間的關(guān)系查閱文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。而目前VNTR分型技術(shù)的相關(guān)研究基本集中在聚類分析，引起其重復(fù)單元拷貝數(shù)變化的影響因素還未明確。本項(xiàng)目通過(guò)耐藥表型和VNTR 分型技術(shù)，探討耐多藥患者的菌株在耐藥表型和VNTR 方面的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明，某些耐藥表型和MIRU-VNTR 位點(diǎn)存在顯著關(guān)聯(lián)，為其具體機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

當(dāng)病菌進(jìn)入休眠狀態(tài)并停止大多數(shù)的代謝活動(dòng)時(shí)，增加了病菌對(duì)抗生素的耐受性，避免藥物對(duì)復(fù)制狀態(tài)中的細(xì)菌造成致命性影響，這種現(xiàn)象被定義為表型耐藥［17-18］。與基因突變和獲得性耐藥不同，結(jié)核菌的表型耐藥只與代謝或生理活性的降低有關(guān)［19-20］。我們的研究結(jié)果顯示，耐多藥結(jié)核菌株的表型耐藥增加到4種時(shí)，與VNTR 位點(diǎn)有顯著關(guān)聯(lián)性，或許耐藥表型的種類增加到一定數(shù)量以上時(shí)，對(duì)VNTR位點(diǎn)的改變才會(huì)明顯增強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，從復(fù)發(fā)或潛伏性結(jié)核病患者中分離出的耐藥表型菌株對(duì)一線結(jié)核病藥物如異煙肼、利福平和乙胺丁醇的耐藥性比其他患者更高［19］，但具體機(jī)制尚未明確。近年來(lái)，由于基因組學(xué)的進(jìn)步，人們對(duì)結(jié)核菌耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)逐漸加深。然而，盡管取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但仍存在進(jìn)一步闡明表型耐藥分子基礎(chǔ)的空間。

MIRU-VNTR 基因分型的重復(fù)單元數(shù)量可以根據(jù)整個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)生的片段大小來(lái)確定。每株分離菌通過(guò)各自重復(fù)單元集的拷貝數(shù)進(jìn)行分型，以此判斷結(jié)核菌是否產(chǎn)生改變。隨著MIRU-VNTR 的可用重復(fù)單元的種類逐漸被發(fā)掘，其分型菌株的能力也會(huì)更強(qiáng)［21］，這樣更容易發(fā)現(xiàn)菌株是否發(fā)生了改變。國(guó)外有研究報(bào)道，希臘流行結(jié)核菌株的基因型與耐藥性之間無(wú)明顯關(guān)聯(lián)［22］，上述結(jié)果與我們的研究相符合。最近伊朗方面通過(guò)MIRU-VNTR 基因分型技術(shù)分析出該地區(qū)的耐多藥結(jié)核菌成簇?cái)?shù)增加［23］，我們則進(jìn)一步從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度出發(fā)，驗(yàn)證了耐多藥結(jié)核菌株的耐藥種類及其表型與遺傳基因的多樣性存在顯著關(guān)聯(lián)，發(fā)生表型變遷（敏感變耐藥、耐藥變敏感）的耐多藥結(jié)核菌中，異煙肼和乙胺丁醇均分別為50.0%、50.0%，鏈霉素和阿米卡星均分別為87.5%、12.5%，左氧氟沙星分別為61.9%、38.1%，莫西沙星分別為64.0%、36.0%。長(zhǎng)期用藥會(huì)導(dǎo)致處于休眠狀態(tài)下少數(shù)耐藥結(jié)核菌存活的現(xiàn)象發(fā)生，當(dāng)其生長(zhǎng)恢復(fù)時(shí)，將重新建立對(duì)藥物的敏感性，產(chǎn)生新的傳播鏈。因此，我們猜測(cè)是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群由于化學(xué)性藥物的長(zhǎng)期抑制或再感染而造成的耐藥性變遷。國(guó)內(nèi)研究表明，中國(guó)南方地區(qū)211 例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的48 位點(diǎn)MIRU-VNTR 基因分型除了18 個(gè)VNTR 位點(diǎn)擴(kuò)增不出、14 個(gè)位點(diǎn)屬于中低分辨率外，其余16 個(gè)VNTR 位點(diǎn)均為高分辨率，且16 位點(diǎn)組合的分辨率高達(dá)0.98［24］。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上，對(duì)16 個(gè)高分辨率的VNTR位點(diǎn)，進(jìn)一步研究表型耐藥與MIRU-VNTR 位點(diǎn)是否存在關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明：異煙肼、阿米卡星和左氧氟沙星的耐藥表型菌株與16個(gè)高分辨率VNTR 位點(diǎn)均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)，而乙胺丁醇、鏈霉素和莫西沙星的耐藥表型菌株則具有顯著關(guān)聯(lián)性，說(shuō)明部分耐藥表型菌株的變化可能由多種基因型的菌株造成，來(lái)自部分結(jié)核高負(fù)擔(dān)區(qū)域的人口遷移不斷增加。

總之，耐多藥結(jié)核分枝桿菌的耐藥變遷與其遺傳的多態(tài)性存在明顯關(guān)聯(lián)，如果增加各病例的流行病學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)，就能夠進(jìn)一步驗(yàn)證是否與特定的高負(fù)擔(dān)地區(qū)有關(guān)，從而明確防治目標(biāo)。但本研究存在不足之處，如樣本來(lái)源不夠廣泛、樣本量較少、缺乏相關(guān)的流行區(qū)域資料以及其他表型耐藥菌株，還需繼續(xù)對(duì)耐藥變遷與VNTR 位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明劉振寧：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)行研究、數(shù)據(jù)分析和文章撰寫；劉志輝：項(xiàng)目管理、課題指導(dǎo)和寫作指導(dǎo)