凝結(jié)芽孢桿菌BC320對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)和血液免疫指標(biāo)的影響

常金濤　李春嶺　劉金珂　丁玉婷　張培鈺

摘要：為驗(yàn)證一株分離自南美白對(duì)蝦體內(nèi)的凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）BC320對(duì)南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）生長(zhǎng)性能和非特異性免疫指標(biāo)的影響，將1 200尾南美白對(duì)蝦（平均體重3.24 g±0.2 g）隨機(jī)分成4組，分別添加0‰、0.5‰、1‰、1.5‰的BC320，每組300尾，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100尾。經(jīng)40 d養(yǎng)殖后，檢測(cè)平均增重率（AWG）、特定生長(zhǎng)率（SGR）、飼料系數(shù)（FC）和成活率（SR）等生長(zhǎng)指標(biāo)和超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）、溶菌酶（LSM）、過(guò)氧化物酶（POD）等免疫指標(biāo)。結(jié)果顯示，終末體重、增重率和特定生長(zhǎng)率指標(biāo)，各處理組與對(duì)照組相比均有顯著增加，但在添加1‰和1.5‰之間沒(méi)有顯著性差異；當(dāng)添加量為1‰時(shí)，試驗(yàn)組的SOD、ACP、ALP和POD與對(duì)照組均有顯著差異，LSM與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，凝結(jié)芽孢桿菌BC320可促進(jìn)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)，提高其非特異性免疫水平。

關(guān)鍵詞：凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）; 南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）; 生長(zhǎng); 血液免疫指標(biāo)

2021年我國(guó)南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）產(chǎn)量占全部蝦產(chǎn)量的35.12%[1]，南美白對(duì)蝦已經(jīng)成為我國(guó)蝦類養(yǎng)殖中的主要品種。然而，近些年由于環(huán)境壓力和病害引起的養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，在一些地區(qū)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。同時(shí)，抗生素和微生態(tài)制劑的使用已成為養(yǎng)殖生產(chǎn)必須關(guān)注的問(wèn)題之一。抗生素與生俱來(lái)的耐藥菌株傳播和抗生素殘留等問(wèn)題，以及大量使用抗生素對(duì)環(huán)境的危害問(wèn)題[3-4]，使微生態(tài)制劑、植物提取物、中藥制劑等成為替代抗生素的熱門種類。水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物顆粒飼料的特殊制作工藝，造成不耐高溫的乳酸菌和酵母菌損失率過(guò)高，而能耐高溫的常用芽孢菌（主要是枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌）不能產(chǎn)生乳酸，在腸道微生態(tài)平衡調(diào)節(jié)方面有所欠缺。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）最早于1915年發(fā)現(xiàn)于腐敗的煉乳中[5]，屬厚壁菌門（Firmicutes），桿菌綱（Bacilli），芽孢桿菌目（Bacillales），芽孢桿菌科（Bacillaceae），芽孢桿菌屬（Bacillus），為兼性厭氧菌，在腸道可抑制有害菌，并能促進(jìn)雙歧桿菌等有益菌的生長(zhǎng)和繁殖。本實(shí)驗(yàn)室于養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦腸道中分離到一株凝結(jié)芽孢桿菌BC320，經(jīng)驗(yàn)證具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力和形成芽孢的能力。為驗(yàn)證凝結(jié)芽孢桿菌BC320對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)和血液免疫指標(biāo)的影響，開(kāi)展了本研究，以期為凝結(jié)芽孢桿菌BC320在養(yǎng)殖生產(chǎn)上的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1菌株來(lái)源及菌劑制備

菌株BC320株為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院病害與微生物實(shí)驗(yàn)室從曹妃甸南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)中采集分離后保藏，從冰箱取出后迅速解凍，以無(wú)菌操作涂布于YPD平板培養(yǎng)基。取單菌落接入液體培養(yǎng)基，發(fā)酵30 h，添加0.5%牛血清白蛋白第五組份（BSA V）作為保護(hù)劑凍干。凍干的菌劑以膨潤(rùn)土調(diào)整活菌數(shù)為1×1010 CFU/g后添加至飼料中。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1飼料配制本試驗(yàn)中使用自制飼料，基礎(chǔ)配方為：進(jìn)口魚(yú)粉57%、酵母粉2.5%、大豆磷脂8%、豆粕18%、雜魚(yú)粉8%、次粉5.5%、氯化鈉0.5%，另加預(yù)混料0.5%。預(yù)混料為市售2‰預(yù)混料并分別添加0‰、0.5‰、1‰、1.5‰的凝結(jié)芽孢桿菌（活菌數(shù)1×10¹⁰CFU/g），用膨潤(rùn)土補(bǔ)足到5%，編號(hào)分別為C0、T1、T2、T3。原料混合后壓制成破碎料和粒徑1.0 mm的顆粒料，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2飼養(yǎng)管理南美白對(duì)蝦（平均體重3.24 g±0.2 g）購(gòu)自山東濱州某育苗場(chǎng)，運(yùn)回后先在2 m×2 m×1 m的暫養(yǎng)池中暫養(yǎng)1周，期間投喂破碎料。暫養(yǎng)結(jié)束后，挑選規(guī)格一致、外觀健康的蝦，隨機(jī)分成4組（對(duì)應(yīng)C0、T1、T2、T3四組飼料），每組300尾，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100尾，使用1.2 m×0.45 m×0.45 m水族箱進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)。

試驗(yàn)期間水溫控制在（28±2）℃，每天投料4次，每隔6 h投1次。試驗(yàn)期間，定期排出水底部沉淀的糞便和雜質(zhì)，每天換水大約30%。開(kāi)始試驗(yàn)時(shí)投飼量按蝦體重的約20%計(jì)算，隨攝食和生長(zhǎng)情況逐步做調(diào)整，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)約按蝦體重的6%計(jì)算。

1.2.3生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)周期40 d。試驗(yàn)開(kāi)始前測(cè)定對(duì)蝦體重記錄為初始體重，試驗(yàn)結(jié)束后停止投料后24 h稱重記錄，為終末體重。試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算以下指標(biāo)：

AWG=（W₁-W₀）/W₀×100%；

SGR=[ln（W₀）-ln（W₁）] /T×100% ；

FC=F_t/W_t；

SR=（N₁/N₀）×100%；

式中：AWG為平均增重率，%；W₁為終末體重，g；W₀為初始體重，g；SGR為特定生長(zhǎng)率，%/d；T為試驗(yàn)天數(shù)，d；FC為飼料系數(shù)；F_t為試驗(yàn)期間攝入的飼料總量，g；W_t：為試驗(yàn)期間總增重，g；SR為成活率，%；N₁為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)尾數(shù)，尾；N₀為試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)尾數(shù)， 尾。

1.2.4血清的生化分析及血清抗氧化分析

試驗(yàn)結(jié)束后，停食24 h，每組選擇10尾蝦從腹部血竇抽取血淋巴，置于2.5 mL的一次性離心管中，4 ℃靜置過(guò)夜，第二天3 000 rpm離心10 min，取上清液保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）、溶菌酶（LSM）和過(guò)氧化物酶（POD）均使用試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）并參考生產(chǎn)商的使用說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)在EXCEL中進(jìn)行匯總并進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），如組間存在顯著差異，則繼續(xù)進(jìn)行最小顯著差異方法（LSD）做多重比較。以P＜0.05表示具有顯著差異。

2結(jié)果

2.1BC320對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響

添加不同比例的凝結(jié)芽孢桿菌BC320對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)的影響見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，添加凝結(jié)芽孢桿菌后，各處理組與對(duì)照組相比終末體重、增重率和特定生長(zhǎng)率均有顯著增加，但T2和T3組之間沒(méi)有顯著差異。1‰添加組飼料系數(shù)為118，在所有試驗(yàn)組中最低；成活率在1‰添加組最高，但不同添加組之間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

2.2BC320對(duì)南美白對(duì)蝦血液生化指標(biāo)的影響

圖1（封三）顯示，SOD在C0組和T2、T3組之間差異顯著，而C0組和T1組之間差異不顯著；T1和T2之間差異顯著而和T3之間差異不顯著。

從圖2（封三）可以看出，添加凝結(jié)芽孢桿菌后，南美白對(duì)蝦血清中的ACP指標(biāo)隨BC320添加量的增加而升高，但在添加量更高的T3組和次高添加量的T2組之間沒(méi)有顯著增加。C0和T1組之間沒(méi)有顯著差異，T2和T3組之間也沒(méi)有顯著差異。

從圖3（封三）可以看出，隨著添加濃度（05‰、10‰和1.5‰）的升高，血清中ALP的濃度也隨著升高。3個(gè)添加濃度對(duì)ALP的升高效果與對(duì)照組C0相比較均為差異極顯著（P＜001）。

從圖4（封三）可以看出，僅在T1組（添加量0.5‰）和對(duì)照組之間的LSM有顯著差異，T2和T3組（添加量分別為1‰和1.5‰）與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異。各處理組之間也沒(méi)有顯著差異。只有T1組與對(duì)照組相比有顯著差異。

從圖5（封三）可以看出，對(duì)照組C0與各處理組之間的POD均有顯著差異（P＜0.05），而不同添加量的處理組之間不存在顯著差異。

3討論

益生菌在生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生淀粉酶[6]、脂肪酶[7]、蛋白酶[8]等多種酶和有機(jī)酸、多肽[9]等物質(zhì)，在動(dòng)物腸道內(nèi)可以幫助宿主消化食糜和吸收營(yíng)養(yǎng)成分，提高宿主對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的更高效利用。一般認(rèn)為，乳酸菌可以在腸道分泌有機(jī)酸，造成較低的pH環(huán)境，抑制病原菌的生長(zhǎng)，并能分泌促生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)對(duì)食物的消化吸收。凝結(jié)芽孢桿菌可以起到類似乳酸菌的作用，表現(xiàn)出促生長(zhǎng)的作用，本試驗(yàn)的結(jié)果和部分其他研究人員的結(jié)果相似[10-11]。

益生菌促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物成活率的提高，一般認(rèn)為是由于益生菌能促進(jìn)宿主腸道微生態(tài)平衡，提高宿主對(duì)不良環(huán)境的抵抗力。本研究中，添加凝結(jié)芽孢桿菌組的成活率在各處理組之間沒(méi)有顯著差異，而和對(duì)照組之間均有顯著差異。

益生菌可以刺激宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫水平的提高，包括促進(jìn)一些非特異性免疫因子分泌的增強(qiáng)等[12]。超氧化物歧化酶SOD在動(dòng)物的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)體系中占有重要地位[13-15]。當(dāng)對(duì)蝦受到環(huán)境脅迫如低氧、高溫等惡劣條件時(shí)，體內(nèi)SOD基因會(huì)應(yīng)激而增強(qiáng)表達(dá)。所以血清中SOD水平的高低可反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。本研究中，SOD在添加0.5‰的處理組和對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異，表明低劑量的凝結(jié)芽孢桿菌不能刺激南美白對(duì)蝦血清中SOD的顯著升高。在袁豐華等[16]的研究中，使用10×10⁹CFU/g的菌劑以0.1%、0.5%和1.0%的比例分別添加進(jìn)尖吻鱸飼料中，飼養(yǎng)50 d后檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)尖吻鱸血清中SOD水平在試驗(yàn)組比對(duì)照組高，但是與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異，可反映出益生菌對(duì)動(dòng)物的影響除了受益生菌種類影響之外，也受動(dòng)物種類、進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)的生理狀態(tài)等的影響。本研究中，使用的凝結(jié)芽孢桿菌添加活菌數(shù)為1×10¹⁰CFU/g，試驗(yàn)動(dòng)物為南美白對(duì)蝦，在低添加量組（T1組，05‰添加）和對(duì)照組之間SOD沒(méi)有顯著差異。在高添加量組（T2組，1.0‰添加；T3組，1.5‰添加）和對(duì)照組之間均有極顯著差異（P＜0.01）。表明，使用益生菌（例如凝結(jié)芽孢桿菌）要達(dá)到益生效果，添加量有一個(gè)閾值，超過(guò)這個(gè)閾值的添加量效果才能體現(xiàn)出來(lái)。在王明陽(yáng)等[10]的研究中，添加凝結(jié)芽孢桿菌的量為1×10¹¹CFU/kg，試驗(yàn)動(dòng)物同樣為南美白對(duì)蝦，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)血清SOD沒(méi)有顯著影響。推測(cè)結(jié)果差異可能的原因是：菌株不同對(duì)宿主的刺激程度有差異；試驗(yàn)動(dòng)物不是同一個(gè)批次，健康狀態(tài)有差異；環(huán)境條件的差異等。

已有多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶ACP與動(dòng)物的免疫水平相關(guān)，在甲殼動(dòng)物等低等生物的非特異性免疫中發(fā)揮重要作用[17-20]。有研究表明ACP的水平與刺激物的劑量有關(guān)，存在劑量依存性[21]。本試驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)ACP的水平隨凝結(jié)芽孢桿菌添加量的增加而增加，即存在劑量依存現(xiàn)象，表明ACP水平可能是機(jī)體免疫監(jiān)測(cè)的一個(gè)常規(guī)指標(biāo)。

堿性磷酸酶ALP可能在機(jī)體受到外源物質(zhì)刺激時(shí)被動(dòng)地升高濃度，以應(yīng)對(duì)可能的危害[22]。本研究中，各處理與對(duì)照組相比ALP均為顯著差異，但T2組的平均值要略低于T1組，可能ALP同樣有添加量范圍的問(wèn)題。

溶菌酶LSM是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分，可以裂解革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中的乙酰氨基多糖，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物[17，23]。本試驗(yàn)中，T1組（0.5‰添加量）和對(duì)照組之間在血清LSM水平有顯著差異，而高添加量組（T1、T2組）和對(duì)照組之間在血清SOD水平?jīng)]有顯著差異，表明LSM水平的升高有一個(gè)最高點(diǎn)。

過(guò)氧化物酶POD是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種氧化酶，主要作用是氧化有害底物防止形成羥基自由基[24]。王俊等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在脊尾白蝦飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌可以提高其血清中POD水平，并且隨著添加量的增加，POD水平也增高。本研究中，南美白對(duì)蝦血清中POD水平也隨添加量增加而升高，并且各處理組（T1、T2、T3）與對(duì)照組相比均為顯著增加。

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Influence of Bacillus coagulans BC320 on the growth

and hematology immune of Penaeus vannamei

CHANG Jintao LI Chunling LIU Jinke DING Yuting ZHANG Peiyu

（1.Aquatic Products Center， Agricultural Science and Technology Service Center， Laoting 063600，China;

2.Cangzhou Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Cangzhou 061000，China;

3.Hebei Academy of Marine and Aquatic Sciences， Qinhuangdao 066200，China;

4.Ocean colleage，Hebei agricultural university， Qinhuangdao 066000，China）

Abstract：In order to evaluate the effects of Bacillus coagulans BC320 on the growth performance and nonspecific immune indicators of Penaeus vannamei， 1 200 shrimps （Penaeus vannamei， average weight 3.24 g±0.2 g） were randomly divided into four treatment， added of 0，0.5‰，1‰ and 1.5‰ BC320 respectively. Each group contains 300 P. vannamei， three replicates. After 40 days of cultivation， the growth indicators such as average weight gain rate， specific growth rate， feed coefficient， survival rate and immune indicators such as superoxide dismutase， acid phosphatase， alkaline phosphatase， lysozyme and peroxidase were tested. The results showed that， the final body weight， weight gain rate and specific growth rate indexes of each treatment group showed significantly increased compared with control group. However， there was no significant difference between 1‰ and 1.5‰ group. Meanwhile 1‰ treatment showed significant differences in SOD， ACP， ALP and POD between the control group and the treatment group. There was no significant difference in LSM between treatment groups and control group. The results showed that B. coagulans BC320 could promote the growth of P. vannamei and improve its non-specific immune level.

Key words：Bacillus coagulans; Penaeus vannamei; growth; blood immune index

（收稿日期：2023-04-04）